专家点评Molecular Plant张华伟/李家洋团队合作开发用以替代先导编辑器的新型基因编辑工具——榫卯连接系统

北京大学现代农业研究院

2025年11月19日 15:58 山东

在作物育种领域，实现精准、无瘢痕的DNA片段插入与替换，是突破品种改良瓶颈和保障国家粮食安全的核心技术。长期以来，我国精准基因编辑技术依赖国外工具先导编辑系统（prime editor），这成为制约农业生物育种自主创新的“卡脖子”难题。

2025年11月18日，北京大学现代农业研究院张华伟团队和中国科学院遗传与发育生物学研究所/崖州湾国家实验室李家洋院士团队的合作研究重要成果在Molecular Plant杂志在线发表（DOI:10.1016/j.molp.2025.11.006），题为“A Mortise-Tenon joint system facilitates precise targeted DNA insertion and replacement in rice”。

A Mortise-Tenon joint system facilitates precise targeted DNA insertion and repl.pdf

该研究成功开发出一种名为“Mortise-Tenon joint system（MT，榫卯连接系统）”的新型基因编辑策略，为精准基因组编辑提供了突破性解决新方案，不仅实现了高效的靶向DNA插入与替换，更有望为大片段基因编辑开辟新路径。其DNA插入与替换效率最高达59.47%，作为PE工具的高效替代技术，为攻克基因编辑育种“卡脖子”问题提供了关键利器。

一、“榫卯”灵感：重构DNA断裂与修复的精准配对

MT系统的核心设计灵感源于中国古建筑传统木工中的“榫卯结构”——通过构建相互匹配的“榫头（tenon）”与“卯眼（mortise）”，实现DNA片段的精准整合（图1）。

1. 独特“卯眼”：定制化DNA双链断裂（DSB）

研究团队依托遗传发育所高彩霞团队此前开发的AFID系统（APOBEC-Cas9-UDG/AP lyase融合系统），在水稻基因组目标位点制造出特殊的DSB结构（即“卯眼”），该结构具有单端或双端非互补的5'- 突出端（粘性末端）。这种非对称断裂方式为定向插入提供了精准“接口”。

2. 匹配“榫头”：设计互补粘性末端供体

针对“卯眼”的5'-突出端，研究团队体外退火合成双链DNA供体（即“榫头”）：供体两端带有与“卯眼”完全互补的5'-粘性末端，且通过5'-磷酸化修饰促进连接反应，同时在两端引入硫代磷酸酯键提升其在细胞内的稳定性，确保供体不被过早降解。

通过“卯眼”与“榫头”的粘性末端互补配对及连接，MT系统可实现DNA片段的定向精准插入；若设计两对PAM-in方向的sgRNA制造双“卯眼”，搭配双5’-粘性末端供体，还能完成精准的片段替换——这种“精准配对、定向整合”的机制，正是MT系统突破传统技术瓶颈的核心。

图1 MT系统原理示意图

二、性能验证：效率与精准度双优

研究团队在水稻多个基因位点开展实验，全面验证MT系统的编辑性能，结果令人振奋。

1. 单TC基序靶点：插入效率最高达48.12%

在仅含单个TC基序的GRF1基因位点（插入21 bp miR156识别序列），MT系统表现出显著优势（图2）：

•MT1（APOBEC3A-Cas9-UDG/AP lyase）与MT2（APOBEC3B-Cas9-UDG/AP lyase）的正向插入效率分别为46.55%、48.12%，且无反向插入；

•传统Cas9系统搭配平端供体时效率仅1%，即使使用1 nt粘性末端供体也仅提升至10.3%；

•精准插入效率方面，MT2达29.04%，是Cas9（1 nt粘性末端供体，6.83%）的4倍以上。

在NRT1.1B（插入miR396识别序列）与ACTIN1（融合3×Flag标签）位点，MT2的精准插入效率分别为28.13%、16.46%，为Cas9系统的1.66-6.10倍，且Western blot验证显示ACTIN1-3×Flag融合蛋白可正常表达。

图2 单TC靶点DNA片段精准插入

2. 多TC基序靶点：精准插入效率峰值59.47%

针对含3个TC基序的IPA1基因位点（插入21 bp miR396识别序列），MT系统通过设计对应不同粘性末端长度的供体，实现高效编辑（图3）：

•当供体为8 nt粘性末端时，MT2的正向插入效率达83.54%，精准插入效率59.47%，是Cas9系统（正向插入效率最高11.09%）的7倍以上；

•在含2个TC基序的SLR1基因5'-UTR区（插入64 bp翻译增强子），MT2精准插入效率33.63%，是Cas9系统的3.35倍以上，且插入后SLR1蛋白水平提升，水稻株高显著降低，验证了编辑产物的有效功能。

值得注意的是，MT系统对粘性末端长度高度敏感，供体粘性末端与“卯眼”不匹配时（如GRF1位点用8 nt/10 nt供体），效率会骤降至1.04%甚至0，这进一步证明其精准配对的核心优势。

图3 多TC靶点DNA片段精准插入

3.片段替换：效率远高于Cas9，且无冗余残留

在NRT1.1B基因内含子区（用21 bp片段替换86 bp序列）与D53基因外显子区（用56 bp片段替换71 bp序列）的替换实验中（图4）：

•传统Cas9系统未检测到有效替换；

•MT2系统在NRT1.1B位点的替换效率达28.53%，精准替换效率21.9%；在D53位点，精准替换效率27.13%，且替换后水稻表现出株高降低、分蘖数增加的预期表型（符合D53基因功能）。

图4 DNA片段精准替换

与PrimeRoot（残留重组酶位点）和TATSI（残留转座子末端重复序列）等技术不同，MT系统的替换过程无任何冗余序列残留，真正实现“无瘢痕编辑”。

三、从实验室到田间，MT系统为作物育种注入新动能

MT系统的开发提供了一种“结构适配、定向整合”的编辑新思路。其最高59.47%的精准编辑效率和无瘢痕特性及稳定遗传表现，使其在水稻功能基因研究和优良性状快速导入（如抗病、抗逆和品质改良）等领域具有广阔应用前景。

随着进一步的研究实现长片段供体制备技术的突破，MT系统有望实现Kb级甚至更大片段的精准插入与替换，为作物复杂性状改良和合成生物学元件整合等难题提供新解法。可以预见，这一源于“榫卯”智慧的基因编辑技术，将成为连接基础研究与农业生产的重要桥梁，为培育更高产、更优质和更抗逆稳产的作物新品种贡献关键力量。

北京大学现代农业研究院张华伟研究员、中国科学院遗传与发育生物学研究所/崖州湾国家实验室李家洋院士为论文的共同通讯作者，北京大学现代农业研究院副研究员孙文静、科研助理朱瑶瑶、中国中医科学院博士生张秀华和中国科学院遗传与发育生物学研究所高级工程师孟祥兵为论文共同第一作者。该研究得到了北京大学现代农业研究院科研助理夏凯、张鑫、韩雪研究员、潘文波博士和中国中医科学院郭娟研究员的帮助。感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员共享AFID和eAFID质粒。相关研究得到山东省泰山学者基金、山东省杰出青年科学基金、国家自然科学基金和国家重点研发计划等项目的资助。

论文链接：

https://www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(25)00393-4

专家点评

中国科学院院士 钱前

榫卯智慧破局：MT系统——精准编辑工具包再添新利器

现代作物育种已迈入以智能精准为核心的4.0代，基因编辑技术的崛起，推动育种方式从随机突变向精准修饰跨越，实现碱基替换、片段插入和缺失等精准操作。这一变革不仅重构了育种产业的技术逻辑，更成为保障粮食安全的核心科技支撑。

在基因编辑工具自主化进程中，中国已取得显著突破：以Cas12系列核酸酶为代表的序列特异性工具酶，搭配自主研发的碱基编辑器，已在多种作物育种中实现应用，舜丰生物的Cas-SF01和齐禾生科的QBEmax等工具更是实现了效率与精准度的双重优化，部分技术已通过国际授权实现"反向输出"。这些成果为我国育种技术从跟跑向并跑转变奠定了坚实基础。

精准基因编辑是突破育种瓶颈的关键——改良作物关键农艺性状的碱基替换及DNA片段的准确插入、替换和删除，都依赖于高效精准的编辑工具。然而，当前主流的精准编辑技术多数基于先导编辑（prime editing，PE）系统开发，其专利垄断成为制约我国育种产业发展的“卡脖子”难题，严重限制了自主创新成果的产业化应用。

为突破这一困境，北京大学现代农业研究院张华伟团队和中国科学院遗传与发育生物学研究所/崖州湾国家实验室李家洋院士团队另辟蹊径，从中国传统古建筑榫卯结构中汲取灵感，研发出新型精准基因编辑工具——榫卯连接系统（Mortise-Tenon joint system，MT）。该系统在此前高彩霞团队开发的APOBEC-Cas9基础上，利用该系统在基因组上形成的“卯眼”粘性末端，创新性的设计携带互补粘性末端的“榫头”双链DNA，结合化学修饰，首次实现了DNA片段高效、定向、无痕的插入、删除与替换。同时利用多个单位点，和双位点策略系统评估了APOBEC3A（MT1）和APOBEC3B（MT2）对于实现精准插入、缺失和替换效率的影响。尤其是MT2在单个位点精准敲入最高效率可达到59.47%。这种模拟榫卯咬合的设计，既规避了PE系统的专利壁垒，又在编辑效率和准确性上展现出独特优势，为精准基因编辑提供了全新技术路径。

MT系统的建立为精准编辑提供了一个全新的选择，虽然其对TC序列的偏好性，一定程度会限制其编辑的广适性，但其较高的精准编辑效率仍将具有广阔的应用前景，尤其是在PE效率相对较低的双子叶植物中。文中关于非靶编辑的问题，更多可能是由于基因枪转化造成的多位点插入，后续可以通过稳转或其他低剂量转化的方法，进一步拓展应用场景提升精准编辑的效率。

该系统的建立将有助于在育种实践中，赋能主粮、经济作物的性状改良，加速高产、抗逆、优质新品种培育，助力破解“抗逆必减产”等行业困局。更重要的是，MT系统的自主知识产权属性，将推动我国精准编辑领域从“技术引进”向“自主创新”转型，增强在全球种业竞争中的话语权，为保障国家种源安全提供核心技术支撑，彰显了传统智慧与现代科技融合的创新力量。

中国农业大学教授 赖锦盛

从“卡脖子”到“破局者”：MT系统引领作物精准基因组编辑技术自主化

作物精准基因组编辑是突破传统育种瓶颈、高效改良农艺性状的核心技术，其发展水平直接决定现代育种产业的竞争力。当前，先导编辑（Prime editor，PE）系统虽为植物精准编辑的主流底层技术，但其核心专利壁垒却成为我国作物育种商业化进程中的关键“卡脖子”难题——不仅抬高了技术应用成本，更严重制约精准编辑技术在主粮、经济作物育种中的规模化落地，使我国在作物性状改良领域的创新潜力难以充分释放。

为打破这一困局，北京大学现代农业研究院张华伟团队和中国科学院遗传与发育生物学研究所/崖州湾国家实验室李家洋院士团队展开联合攻关，成功开发榫卯连接系统（Mortise-Tenon joint system，MT），首次通过创新性分子设计突破PE技术在精准编辑领域的核心壁垒。该系统深度借鉴中国传统榫卯结构的咬合智慧，利用APOBEC-Cas9-UDG/AP lyase复合物在基因组靶位点构建独特双链断裂结构：产生带有单端或双端5'-单链突出端的“卯眼”，再匹配携带完全互补粘性末端的双链DNA供体“榫头”，通过末端特异性捕获与连接机制，精准实现DNA片段的插入与替换。

这一创新性巧妙设计兼具“精准性”与“高效性”双重优势：一方面彻底解决编辑位点“残留序列”难题，无需依赖重组酶或转座酶，避免任何冗余序列残留，完美适配作物编码区修饰、调控元件精准改造等对序列完整性要求极高的场景；另一方面以极简操作流程实现高效编辑，在水稻18个靶位点的测试中，精准插入与替换效率稳定达到16.30%-59.47%。MT系统也为大片段编辑提供了可行路径——未来只需优化带有互补粘性末端的长片段供体制备技术，即可实现基因组大片段的精准插入与替换，为攻克复杂性状改良难题奠定基础。

作为我国植物基因组编辑领域的突破性创新成果，MT系统不仅填补了自主精准育种底盘技术的空白，更将推动精准编辑技术从基础研究向农业生产实践深度转化。随着供体递送方式和长片段供体制备等配套技术的持续优化，MT系统有望成为作物育种的核心工具，在保障国家粮食安全和培育优质高产主粮新品种中发挥变革性作用，为我国种业科技自立自强提供关键技术支撑。