导语：

在活细胞荧光成像中，如何将大分子、带电或亲水性荧光探针高效递送至细胞质内，一直是科研人员面临的重大挑战。近年来，细胞穿透肽作为一种高效、低毒的递送载体，为活细胞成像技术带来了革命性突破。今天，我们带您深入解读华中科技大学武汉光电国家研究中心张玉慧教授团队近期发表于《Journal of Innovative Optical Health Sciences》的综述论文，系统梳理穿膜肽（CPP）技术在荧光探针递送中的最新进展与未来展望。

Advances in cell-penetrating peptides for cytoplasmic delivery of fluorescent probes

Simei Zhong, Peng Xu, Yunfei Wei, Xinxin Duan, Shanshan Zhao, and Yu-Hui Zhang

Journal of Innovative Optical Health Sciences Vol. 19, No. 01, 2530012 (2026)

https://www.worldscientific.com/doi/10.1142/S1793545825300125

正文：

一、CPP：从发现到分类

CPP是一类由5-30个氨基酸组成的短肽，能高效穿透细胞膜并递送蛋白质、核酸及药物等“货物”。其研究始于1988年HIV Tat蛋白的跨膜活性发现，随后逐渐拓展出天然来源与人工设计两大类，目前已收录近1700种序列。根据物化性质，CPP主要分为阳离子型（富含精氨酸/赖氨酸，如TAT）、两亲性型（兼有亲水与疏水结构域）和疏水型（富含疏水残基）。它们可通过共价连接（如肽键、二硫键）或非共价组装（静电/疏水作用）与荧光探针结合，实现高效胞内递送。

二、CPP如何进入细胞？关键机制解析

CPP主要通过两种途径进入细胞：直接转位与内吞作用。直接转位依赖CPP与细胞膜的静电相互作用，通过瞬时扰动脂双层结构，使肽-货物复合物直接穿过细胞膜。内吞作用则是更常见的途径，CPP-货物复合物通过巨胞饮、网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞等方式进入细胞，并被包裹在内体中。

进入内体后，高效的内体逃逸是递送成功的关键。目前主流机制包括：

1.“质子海绵效应”：CPP中的组氨酸等残基缓冲内体酸化，引发渗透压升高，最终导致内体膜破裂。

2.“囊泡出芽复合体（VBC）”机制：CPP诱导内体膜局部出芽形成小囊泡，随后迅速坍缩，将货物释放至胞质。这一过程可循环发生，实现高效、可控的递送。

理解这些机制，有助于理性设计更智能、高效的CPP递送系统。

图1：CPP直接跨膜机制示意图

图2：内吞途径与VBC机制示意图

三、主要递送策略与代表性进展

为提高递送效率，研究者发展了多种CPP改造策略，并基于这些高性能的细胞穿膜肽，成功实现了多种荧光探针，包括荧光蛋白、有机染料、纳米颗粒的递送，实现微管、线粒体、内质网等细胞器的高分辨、长时程活细胞成像。

1. 序列修饰 ：引入组氨酸、谷氨酸等pH响应残基，增强内吞体逃逸；加入色氨酸、苯丙氨酸等疏水残基，可有效增强CPP的膜相互作用与内体逃逸能力。2017年，Futaki团队基于蜘蛛毒液肽开发了L17E，通过在疏水面引入谷氨酸，使其在酸性内体中恢复膜裂解活性，实现了约40%的IgG-Alexa488胞质递送。2020年该团队进一步优化获得HAad，通过替换为氨基己酸并降低电荷，将递送效率提升至75%。2019年，Okuda等人通过延长疏水序列、增加D-精氨酸并扩展精氨酸片段，开发了Pas2r12，成功实现了EGFP与IgG等大分子的高效胞质递送，为稳定型CPP设计提供了新范式。2019年，Zhao等人设计出由交替D-精氨酸与苯丙氨酸组成的六肽rFrFrF，与TAMRA偶联后形成线粒体探针，在活细胞中实现长达三天的稳定线粒体成像，性能优于传统MitoTracker染料。2025年，张玉慧团队通过在寡聚精氨酸序列中引入罗丹明B基团，增强疏水性，构建了高细胞穿透能力的穿膜肽fR8，成功解决了纳米探针的内体滞留难题，实现了高达75.6%的胞质递送效率，并用于内质网等细胞器动态的高分辨、长时程观测。

2. 环化设计：通过环化提升结构刚性，增强膜亲和性与递送效率。代表性环化CPP包括cTAT、cR10、cFΦR4及CPP12等，其环状结构有助于促进“囊泡出芽复合体（VBC）”等内体逃逸机制。Nischan等人证实cTAT递送GFP的效率显著高于线性TAT。Herce等人将cR10与纳米抗体融合，开发出细胞穿透性探针GBP1-cR10，可在活细胞内无转染可视化蛋白质互作。Pei团队开发的cFΦR4在递送小分子与蛋白质方面优于经典CPP。进一步优化获得的CPP12，其摄取效率较TAT提升高达60倍，展现了环化策略的强大潜力。

3. 杂化与寡聚化 ：通过融合或组合具有不同功能的肽段（如细胞摄取增强肽与膜裂解肽），或通过寡聚化（二聚、三聚）增强CPP的膜相互作用与内体逃逸能力，可协同提升递送效率。2019年，张玉慧团队通过将罗丹明B标记的TAT二聚化，构建了细胞穿膜肽PV-1，可高效递送22种以上细胞不透性有机荧光探针，实现多细胞器特异性标记与多色成像。随后，2023年该团队进一步通过将PV-1与L17E组合，开发了mixLVP混合肽系统，实现了高达97%的探针递送效率和近100%的内体逃逸效率，且细胞毒性极低。该系统支持多色、长时程超分辨成像，并首次直接观测到哺乳动物细胞中过氧化物酶体在内体上的“搭便车”现象。2020年，Jan Vincent V团队将巨胞饮诱导肽SN21与膜裂解肽LK15融合，可同时提升细胞摄取与胞质释放，实现IgG-AF488等大分子探针的有效递送。2021年，Hackenberger团队开发的硫醇反应性富精氨酸肽（如TNB-R10），可作为CPP添加剂，通过促进细胞表面二硫键形成，辅助蛋白质-CPP复合物以非内吞方式直接进入胞质，实现了功能性抗体与核定位蛋白的高效递送。

4. 化学增强剂：通过添加小分子化学试剂，可非共价增强CPP的穿膜活性与递送效率。常用增强剂包括芘丁酸盐（PyB）、全氟脂肪酸、杯芳烃、DMSO等，它们可通过改变膜流动性、促进CPP聚集或辅助内体逃逸等机制发挥作用。PyB作为经典的阴离子反离子激活剂，PyB可与富含精氨酸的肽（如R8）形成电中性复合物，显著提升其跨膜效率，实现Alexa488及EGFP等探针的快速胞质递送。Basilio团队开发的光控杯芳烃，可通过E/Z异构化远程调控CPP活性，实现了TAMRA-R8递送过程的光控操作，为时空精准递送提供了新工具。

四、挑战与未来

尽管CPP技术已取得显著进展，其分子机制尚未完全阐明，货物依赖性较强，尤其对大尺寸纳米探针的递送仍具挑战。未来，结合分子动力学模拟、高通量筛选与多策略融合，有望推动CPP向更高效、更安全的定向递送系统发展。

结语

尽管CPP介导的递送已取得显著进展，但其分子机制、针对不同货物的普适性优化等仍是未来挑战。结合分子动力学模拟、高通量筛选及多种递送策略的融合，将推动开发更高效、更安全的下一代胞质递送系统，为疾病诊断、药物递送与细胞生物学研究提供更强有力的工具。

通讯作者简介

张玉慧：华中科技大学武汉光电国家研究中心教授，研究方向为用于活细胞超分辨成像的有机荧光探针研究及其应用，细胞器互作方式、互作的动态过程和动态网络绘制。更多详情见：http://faculty.hust.edu.cn/zhangyuhui/zh_CN/index.htm

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