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[转载]【好文荐读】海南大学王亚龙副教授:优于商用探针ThT的AIE型水溶性免漂洗Aβ探针的开发

已有 404 次阅读 2024-1-10 16:02 |系统分类:论文交流|文章来源:转载

本文介绍的是海南大学生物医学工程学院王亚龙副教授对AIE型水溶性免漂洗Aβ探针的设计与研究,发表在《Journal of InnovativeOptical Health Sciences》期刊2023年第6期。

Development of water-soluble AIE-based wash-freeAβprobes superior to commercial ThT

优于商用探针ThT的AIE型水溶性免漂洗Aβ探针的开发

Ting-Ting Hou, Ying-Hao Tang, Zhen-Yu Zhang, Ze-Jun Liand Ya-Long Wang*

研究背景

目前,阿尔茨海默病(AD)是一种典型的神经退行性疾病。淀粉样蛋白(Aβ)是与AD进展相关最突出的病理生物标志物之一。荧光成像具有成本低、操作简单、数据分析容易等优点,更适合动物研究。因此,针对Aβ发展早期诊断技术,设计开发能在体内外特异性靶向Aβ的荧光探针,对于AD的研究具有重要的意义。荧光探针在生物医学领域的应用不仅为生物物种的各项生理活动(细胞、亚细胞)提供了直接可视化的能力。然而,由于聚集诱导猝灭(Aggregation-Caused Quenching,ACQ)现象,导致传统荧光探针信噪比低、易光漂白,限制了它在生物系统中的应用。聚集诱导发光(Aggregation-Induced Emission,AIE)的发现为这一难题带来了解决方案。

内容简介

传统的Aβ探针,包括商用探针ThT,染色过程通常需要繁琐的漂洗步骤。本文中,作者设计了两种AIE活性的水溶性Aβ探针DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH(图1),与商用探针ThT相比,DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH对Aβ聚集体表现出更好的亲和力。此外,对于ThT,漂洗步骤对获得AD脑组织切片中Aβ斑块的高信噪比图像是必不可少的。而对于DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH,即使不需要漂洗步骤,也能获得Aβ斑块的高信噪比图像。

图文导读

1.探针结构设计

基于ThT,设计了AIE活性的水溶性Aβ探针。苯胺基团作为电子供体(D)和Aβ结合基团,吡啶阳离子作为电子受体(A)和水溶性基团。通过碳-碳双键(C=C)桥接,构建了具有D-A结构的水溶性探针DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH。它们在生理环境中不发射荧光,但在与Aβ聚集体结合后发出强烈的红色荧光。与Aβ的商用探针ThT相比,两种AIE活性的Aβ探针表现出优异的灵敏度和亲和力,即使没有繁琐的洗涤程序,也能在AD脑组织切片中以高SNR标记Aβ斑块。

图1:红色荧光的AIE型水溶性Aβ探针的设计

2.探针的光学性质

在水溶液中测量了ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH的紫外-可见吸收和光致发光(PL)光谱。ThT的最大吸收峰和发射峰分别位于~410 nm和~480 nm。与ThT相比,DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH的最大吸收峰位于~480 nm处,由于共轭结构的延伸,红移~70 nm。它们的发射峰位于~630 nm处,与ThT相比,红移了~150 nm(图2)。

图2:(a)ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH在水中的紫外-可见吸收光谱。(b)ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH在水中的发射光谱。

3.探针的AIE性质

由于探针DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH是水溶性化合物,因此它们可溶于极性溶剂水,难溶于低极性溶剂四氢呋喃(THF)。因此,研究了它们在THF/水混合物中的AIE特性(图3)。由于非辐射跃迁,探针在水中显示出微弱的发射。当添加不良溶剂THF时,由于分子内运动受限(RIM)激活了辐射跃迁,荧光开启。荧光随着THF含量的增加而逐渐增强。当THF含量提高到99%时,DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH的荧光显著增强,发射比在水中分别增强约25倍和79倍。结果表明,DE-V1-PYOH和DE-V1-PYC3都是典型的AIE水溶性分子。探针在水中的荧光可以忽略不计,有利于在生物检测中降低背景干扰,实现“off-on”检测。

图3:DE-V1-PYC3(a)和DE-V1-PYOH(b)在不同THF含量的THF/水混合物中的发射光谱。染料浓度:10μM。

4.探针与Aβ纤维的亲和力

作为水溶性化合物,DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH 在PBS(10 mM,pH = 7.4)中荧光可忽略不计。加入10μM Aβ1-42纤维后,ThT的荧光强度增加了近16倍,DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH的荧光强度分别增加了近22倍和18倍(图4a-b)。为检验水溶性对Aβ纤维的亲和力,比较了探针DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH与商用Aβ探针ThT的亲和力。通过将ThT(5μM)与Aβ聚集体(10μM)预混合,制备了ThT/Aβ1-42聚集体,在~486 nm处显示出强烈的绿色发射。当逐渐加入DE-V1-PYC3(0-3μM)时,ThT在486 nm处的荧光急剧减弱,而DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH在605 nm处的荧光急剧增加(图4c-f)。这可能是由于DE-V1-PYC3/DE-V1-PYOH取代了ThT/Aβ1-42聚集体中的ThT,表明DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH与Aβ聚集体的亲和力优于商用探针ThT。

图4:DE-V1-PYC3(a)和 DE-V1-PYOH(b)在不同 Aβ1-42纤维含量的PBS溶液中的发射光谱(染料浓度:2μM)。DE-V1-PYC3(c)和DE-V1-PYOH(e)可有效置换ThT/Aβ1-42纤维复合物中的ThT。486 nm和605 nm处峰的发射峰强度随DE-V1-PYC3(d)和DE-V1-PYOH(f)浓度的变化趋势。

5.分子对接模型及理论计算

利用薛定谔软件进行模拟计算,研究了ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH与Aβ的结合模型。结果表明,这三种分子都可以插入Aβ的空腔中,并与氨基酸残基产生相互作用,从而限制了分子的运动(图5)。因此,由于分子内运动(RIM)的限制,ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH对Aβ表现出优异的荧光响应。与ThT相比,DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH与Aβ空腔内氨基酸残基产生更多的相互作用,因此对Aβ的亲和力优于商用探针ThT。

图5:ThT(a)、DE-V1-PYC3(b)和 DE-V1-PYOH(c)的三维模型与Aβ纤维结合。虚线表示分子与Aβ纤维氨基酸残基的相互作用,黄色虚线表示氢键相互作用,粉红色虚线表示盐桥。

6.荧光共定位成像

图6:AD小鼠脑组织切片中Aβ斑块的荧光成像。(a)(e)ThT染色、(b)DE-V1-PYOH染色和(f)DE-V1-PYC3染色。(c)(g)合并的图像。(d)(h)皮尔逊相关系数分析。比例尺:50μm。

为了验证DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH对Aβ斑块的靶向性,进一步对AD小鼠(5xFAD,9个月)脑组织中的Aβ斑块进行了共定位染色。共定位成像显示,DE-V1-PYC3发出的红色荧光斑点与ThT的绿色荧光斑点几乎重叠,Pearson相关系数(Rp)为0.91(图6a-d)。同样,DE-V1-PYOH发出的红色荧光斑点与ThT的绿色荧光斑点几乎重叠,Pearson相关系数(Rp)为0.96(图6e-h),表现出优异的靶向性。

7.免漂洗成像

进一步对ThT、DE-V1-PYOH和DE-V1-PYC3染色的AD脑组织切片进行免漂洗试验。对于ThT,免漂洗样本显示出较强的背景干扰,信噪比为~4。用50% EtOH/H2O漂洗后,背景荧光显著降低,信噪比提升至~15。而对于DE-V1-PYOH和DE-V1-PYC3,免漂洗和漂洗样本的背景干扰都很弱,表现出较高的信噪比,分别为~14 和~18。结果表明,与ThT相比,DE-V1-PYOH和DE-V1-PYC3无需繁琐的漂洗步骤即可清晰的标记Aβ斑块,这将有效提高标记效率。

图8:ThT(a-c)、DM-V1-PYOH(d-f)和DM-V1CN-PYOH(g-i)的免漂洗成像研究。(a)(d)(g)免漂洗,(b)(e)(h)漂洗。(c)(f)(i)黄线区域的信噪比。比例尺:50μm。

通讯作者简介

王亚龙,海南大学生物医学工程学院副教授,博士生导师。长期从事有机光功能材料的开发及应用研究。在JACS、CEJ、ACS AMI等期刊发表SCI论文20余篇。主持各类国家、省部级项目2项,授权国内发明专利6项。



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