近日，发表于 Mitochondrial Communications 的一项研究提出了一种化学–遗传学靶向新策略，通过新型电压探针 RhoVR-CPM 与线粒体靶向酯酶的协同作用，实现了高特异性、高信噪比的线粒体膜电位成像，为线粒体电生理研究提供了重要的新工具。

图 1.化学–遗传学靶向策略示意图：RhoVR-CPM 仅在进入线粒体后被靶向酯酶特异性解笼，并 preferentially 定位于线粒体内膜，通过光诱导电子转移（PeT）机制响应膜电位变化

一、研究背景与核心挑战

科学问题一：如何避免探针“提前激活”？

传统电压敏感性荧光探针（如SPIRIT RhoVR）依赖不稳定的乙酰氧甲酯（AM酯）进入细胞，但AM酯易在胞质中提前水解，导致探针未达线粒体就“失效”，造成非特异性信号干扰。

科学问题二：如何实现探针在亚细胞器水平的精准定位？

即便探针进入线粒体，也常因未能固定在膜上而快速扩散，难以持续稳定监测膜电位变化，尤其无法分辨不同线粒体亚群之间的动态差异。

二、RhoVR-CPM + 靶向酯酶：双保险实现精准定位

研究团队开发了新型电压探针RhoVR-CPM，并用基因工程手段在线粒体内表达特异性酯酶（如猪肝酯酶PLE），形成一套“探针+酶”的化学-遗传学靶向系统。

原理：光照激发后，荧光分子中的电子进入激发态；在线粒体高膜电势条件下，跨内膜电场抑制分子内光诱导电子转移（PeT），使电子更倾向于辐射跃迁并产生荧光；当膜电势下降时，该抑制作用减弱，PeT 增强，荧光信号随之降低。

关键技术亮点：

CPM酯取代AM酯：CPM酯结构更稳定，不易在胞内非特异性水解，显著降低背景信号。

线粒体靶向酯酶：通过Su9靶向序列将外源酯酶（PLE或BS2）精准导入线粒体基质。

酶促激活：仅当RhoVR-CPM进入线粒体，才被局部表达的酯酶水解激活，从而“锁定”在线粒体内膜，实现长期、稳定、可逆的电压检测。

成像验证结果：

共聚焦与超分辨率成像显示，RhoVR-CPM与线粒体标志物MitoTracker高度共定位，且非特异性信号显著低于前代探针。在表达靶向酯酶的细胞中，探针在线粒体内的富集度进一步提升。

三、超分辨率显微镜 + 荧光寿命成像：看清每一个线粒体的“电压面孔”

研究进一步结合高分辨率三维共聚焦成像与荧光寿命成像（FLIM），首次在单线粒体水平实现了膜电位的高分辨率动态监测。

高分辨率三维共聚焦成像：清晰显示RhoVR-CPM与靶向酯酶在线粒体基质内共定位，证实探针与酶在亚线粒体水平“相遇”，实现精准激活。

FLIM电压成像：利用RhoVR-CPM的荧光寿命对膜电位敏感的特性，成功捕捉到线粒体在正常状态与解偶联剂FCCP处理后的电位变化，寿命差异显著，验证了该探针对Ψm的动态响应能力。

四、技术优势与未来展望

优势总结：

特异性高：探针仅在线粒体内激活，显著降低背景干扰。

可逆响应：基于PeT机制，可实时反映膜电位动态。

兼容多模成像：适用于共聚焦、超分辨、FLIM等多种成像平台。

模块化设计：靶向系统可适配不同酯酶与荧光蛋白，扩展性强。

局限与展望：

依赖外源酯酶表达，需转染或转基因操作，在体内应用中仍具挑战。

未来可进一步优化探针光谱、开发近红外版本，提升活体深层成像能力。

结合代谢组学、蛋白质组学，在神经退行性疾病、代谢性疾病等模型中推动线粒体功能与功能障碍的机制研究。

五、总结

本研究构建的“RhoVR-CPM + 线粒体靶向酯酶”化学-遗传学成像系统，有效解决了传统电压探针定位不准、背景信号高的问题，实现了活细胞中线粒体膜电位的高特异性、可逆且高时空分辨率成像，为线粒体生物能量学及相关疾病机制研究提供了重要的新方法学支撑。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S259027922500015X

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