本研究通过整合多源数据库，系统筛选了尼古丁的潜在神经毒性靶点。从ChEMBL、SwissTargetPrediction、SuperPred和STITCH数据库中获取159个尼古丁作用靶点，同时从GeneCards和OMIM数据库中收集到4302个神经毒性相关靶点。经过去重与比对，筛选出100个共同靶点，构成尼古丁诱导神经毒性的潜在靶标集合（图1A）。进一步利用String数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络，并通过Cytoscape进行可视化分析，揭示了这些靶点之间的紧密关联（图1B）。

GO功能富集分析表明，这些潜在靶点显著富集于突触功能相关过程，如“突触后膜电位调节”和“神经递质受体活性”（图1C）。KEGG通路分析进一步显示，“神经活性配体－受体相互作用”“钙信号通路”以及“成瘾”相关通路是受尼古丁影响的核心信号途径（图1D）。计算分析结果表明，尼古丁可能通过扰乱突触稳态与钙信号平衡，触发后续的神经毒性级联反应。

图1. 尼古丁在神经毒性作用中的潜在靶基因及其生物功能鉴定。(A) 韦恩图展示尼古丁相关靶基因与神经毒性相关靶基因的重叠区域，其中交集基因被视为尼古丁在神经毒性作用中的潜在靶点。(B) 针对100个潜在靶基因构建的蛋白质相互作用网络，其中Cluster1基因以红色标注，Cluster2基因以绿色标注。(C) 潜在靶基因GO富集分析直方图，展示每个GO术语的前10大富集类别。(D) 潜在靶基因KEGG富集分析桑基图，包含前10大显著富集通路。

基于上述100个潜在靶基因所构建的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图1B），研究进一步采用Cytoscape软件中的“MCODE”插件进行模块聚类分析。其中，聚类得分最高的两个模块——Cluster1与Cluster2，得分分别为10和5.3（图2A-B）。为识别模块中的关键调控节点，团队运用“cytoHubba”插件集成的多种拓扑算法（包括MNC、EPC、Degree、Closeness和Radiality）进行核心基因筛选（图2C-D）。分析最终锁定六个核心基因：在Cluster1中鉴定出CHRNA1、CHRNA3和CHRNB1；在Cluster2中鉴定出STAT3、HIF1A和CXCR4。这些基因构成尼古丁诱导神经毒性的关键分子靶标集合，为后续机制验证提供了重点方向。

图2. 核心基因鉴定。(A) 使用Cytoscape中“MCODE”插件获得的聚类得分最高的模块，标记为Cluster1。(B) 使用Cytoscape中“MCODE”插件获得聚类得分第二高的模块，标记为Cluster2。(C) 通过“MNC、EPC、Degree、Closeness和Radiality”算法在Cluster1中识别出的核心基因。(D) 通过相同算法在Cluster2中识别出的核心基因。Cluster1和Cluster2的核心基因在(A)和(B)中以橙色标示。

为深入揭示尼古丁对上述六个核心靶点的直接作用机制，研究团队进一步开展了分子对接模拟分析。结果显示，尼古丁与所有六个核心靶蛋白均可自发结合，结合能均为负值，提示其在生理条件下具备稳定的靶向结合能力，进一步印证了这些靶点在尼古丁神经毒性中的关键地位。具体而言，尼古丁与CXCR4、CHRNB1、CHRNA1、CHRNA3、STAT3及HIF1A的结合能依次为−5.6 kcal/mol、−5.4 kcal/mol、−5.4 kcal/mol、−5.0 kcal/mol、−4.6 kcal/mol与−4.2 kcal/mol（图3G），均表现出较强的结合亲和力。该结果从计算模拟层面支持了尼古丁可能通过直接作用于这些核心蛋白，进而干扰“神经活性配体－受体相互作用”“钙信号通路”及“成瘾相关通路”等，最终引发神经毒性效应。本研究为后续实验验证提供了重要的模拟依据，深入机制仍有待进一步通过生物学实验加以阐明。

图3. 尼古丁与核心蛋白质的分子对接模拟。（A-F）各靶标蛋白与尼古丁的分子对接。（G）各靶标蛋白与尼古丁的最小结合能。

在环境相关浓度下暴露尼古丁，斑马鱼胚胎的发育过程受到显著干扰。研究发现，尼古丁可导致胚胎孵化延迟，具体表现为72 hpf孵化率下降；同时引起生长抑制，96 hpf幼体体长显著缩短（图4A、B、E）。此外，尼古丁还诱发明显的心脏功能紊乱，在48 hpf时心率随暴露浓度升高而增加，至72 hpf则呈现倒U型异常波动（图4C-D）。这些结果一致表明，在真实环境可检出的浓度范围内，尼古丁已足以干扰斑马鱼胚胎的正常发育与心脏节律，提示其具有明显的发育毒性。

图4. 发育表型指标。(A) 对照组与尼古丁暴露组斑马鱼幼鱼在96小时受精后（hpf）的代表性图像。(B) 斑马鱼胚胎在72小时受精后孵化率及120小时受精后存活率。(C-D) 尼古丁暴露条件下斑马鱼幼体在48小时及72小时受精后的心率变化。(E) 尼古丁暴露条件下斑马鱼幼体在96小时受精后的体长测量。数据以均值±标准误（SEM）表示，星号标记采用方差分析的多组比较中具有统计学意义（仅显示暴露组与对照组间的显著差异）；* p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001。

行为学分析是评估污染物神经毒性的敏感手段。本研究首先检测了斑马鱼胚胎最早期的神经运动输出——自发性尾部摆动。尼古丁暴露呈现双相效应：在0.3–3 µg/L环境相关浓度下，尾部摆动频率轻微增加，提示低剂量兴奋作用；而在30–800 µg/L较高浓度下，摆动被显著抑制，表明出现了神经功能抑制或发育障碍（图5A）。

为进一步评估更高级的神经行为功能，研究测定了幼体在明暗交替刺激下的游泳活动。斑马鱼幼体的活动具有光依赖性，在黑暗期活动显著增强。分析发现，尼古丁暴露扰乱了这种正常的行为模式。低浓度（0.03–3 µg/L）暴露表现出一定的抗焦虑样效应，而高浓度（30–800 µg/L）则加剧了焦虑样行为，具体表现为在明暗转换时的活动爆发模式改变以及在开放区域（中央区）停留时间延长（图5B-D）。这些结果表明，尼古丁不仅干扰基础神经回路功能，还会影响与焦虑、风险评估相关的复杂行为，其效应具有显著的浓度依赖性。

图5. 尼古丁对斑马鱼幼体运动行为的影响。(A) 24小时后自发运动频率。(B) 斑马鱼幼体在明暗交替挑战期间每分钟游动距离的时间序列（每组24尾）。不同颜色曲线代表不同处理组。(C) 尼古丁暴露条件下斑马鱼幼体在明暗周期内中央区域停留时间（n=3）。(D) 热力图显示不同尼古丁浓度对斑马鱼幼体的效应。与对照组相比：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。Ns 表示无显著性差异。

靶向代谢组学分析进一步从神经化学层面揭示了尼古丁的扰动效应。主成分分析显示，高浓度尼古丁暴露组的神经递质谱与对照组明显分离，而低剂量组也呈现出偏离趋势，表明神经递质网络在环境相关浓度下已开始失衡（图6A）。同时，RT-qPCR结果证实，多个关键神经发育与功能相关基因（如olig2、slc17a7a、gfap、egr1和bdnf）的表达发生显著改变（图6B）。这些结果共同表明，尼古丁暴露不仅干扰了神经递质的动态平衡，也影响了神经发育与可塑性相关基因的转录程序，从而从化学与分子层面解释了其神经毒性效应的基础。

图6. 尼古丁对斑马鱼神经递质的影响。（A）神经递质数据的主成分分析（PCA）。（B）斑马鱼幼鱼接触尼古丁后神经发育相关基因表达的热图。

为在机制层面深入解析尼古丁的神经毒性，研究对3 µg/L浓度暴露下的斑马鱼幼体进行了转录组测序分析。共鉴定出686个差异表达基因，其中55个上调，631个下调（图7A-B）。GO功能富集分析提示，“氧结合”与“血红蛋白复合体”相关功能显著紊乱（图7C），表明尼古丁可能引发继发性缺氧应激，从而加剧神经细胞损伤。KEGG通路富集结果进一步证实，“神经活性配体－受体相互作用”和“钙信号通路”均发生显著失调，这与前期网络毒理学预测高度一致（图7D）。值得注意的是，促进钙内流的基因（如Trpc）与抑制钙外流/缓冲的基因（如Atp2b、Calb）共同失调，从转录水平支持了钙稳态失衡的假说。

此外，研究还发现“MAPK信号通路”被显著激活，并与炎症－凋亡进程紧密关联。多个关键促凋亡因子，包括凋亡执行蛋白Caspase家族成员、Bax/Baxa以及核心调控因子p53，均呈现显著上调，提示程序性细胞死亡通路被激活。综合上述结果，本研究提出尼古丁可能通过双重机制诱发神经毒性：一方面，过度激活尼古丁乙酰胆碱受体（nAChR）导致钙离子超载，进而诱导线粒体功能障碍；另一方面，MAPK炎症级联反应（尤其是JNK/p38磷酸化）驱动神经炎症与细胞凋亡。该过程与缺氧应激相互叠加，最终导致突触可塑性受损与运动神经元退化，系统阐明了尼古丁从分子扰动到细胞损伤的完整毒性通路。

图7. 尼古丁暴露后斑马鱼幼体的转录组变化。（A）主成分分析。（B）差异表达基因的火山图。（C）差异表达基因的GO富集分析。（D）差异表达基因的KEGG富集分析。

最终，研究通过整合网络毒理学预测与转录组学实验结果，系统识别出17条高度重合的信号通路（图8A-B）。整合分析揭示了各毒性模块之间存在清晰的时序与因果关系：MAPK信号通路的激活是推动神经元凋亡的上游事件，而凋亡所致的神经元丢失则构成了下游神经递质失衡（如多巴胺耗竭）的生物学基础。代谢组学所观测到的神经化学扰动与转录组学所揭示的MAPK介导的凋亡信号（如mapk8、bax基因上调）相互印证，形成了从基因表达改变到细胞功能损伤的完整证据链。

基于此，本研究构建了尼古丁诱导神经毒性的统一不良结局通路（AOP）（图8C）：尼古丁首先通过干扰神经活性配体－受体相互作用引发钙信号紊乱与钙超载；进而激活MAPK炎症级联与氧化应激；同时扰动p53与FoxO信号，导致细胞周期失调与神经元修复能力下降；加之间隙连接与关键代谢通路受损，细胞间通讯与神经保护功能进一步削弱。最终，这些多层次的分子事件协同作用，共同导致突触功能障碍、神经元凋亡，并表现为发育迟缓、运动异常等宏观表型。该AOP框架系统整合了从分子起始事件到个体水平效应的完整毒性路径，为科学评估尼古丁的生态与健康风险提供了机制蓝图。

图8. 尼古丁诱导神经毒性的机制综合分析。(A) 展示转录组学与网络毒理学富集通路重叠数量的维恩图。(B) 转录组学与网络毒理学重叠通路的ID及名称。(C) 尼古丁诱导神经毒性的不良结局通路（AOP）假说。

综上，本研究证实尼古丁在环境相关浓度下即可诱导斑马鱼发育期神经毒性，其典型表型特征包括：发育延迟、运动行为异常及神经递质系统失衡。机制研究揭示，由神经活性配体-受体相互作用紊乱触发的钙信号失调与MAPK介导的炎症－凋亡级联，是尼古丁神经毒性的关键分子事件。这一发现不仅系统阐明了尼古丁从分子起始事件到个体行为异常的完整毒性通路，更提示此类精神活性污染物可能通过干扰保守的神经信号网络，对水生生物发育早期神经系统构成潜在风险，为相关环境基准制定与生态风险评估提供了重要的机制依据。

【原文链接】

Yu Kou, Changsheng Guo, Yan Zhang, Yanghui Deng, Xingxing Yin, Jian Xu, An integrated approach unveils novel mechanisms of nicotine-induced neurotoxicity in zebrafish larvae. Environmental Chemistry and Ecotoxicology 2026, 8, 749-759. https://doi.org/10.1016/j.enceco.2025.12.014.

          【期刊介绍】

Environmental Chemistry and Ecotoxicology (缩写ENCECO) 主要聚焦化学品在全球环境中的传输规律及其在生态系统中的毒性机制，生物体中的生物利用度和生物蓄积性，食物链中的生物放大，以及生态系统分析中的新技术和新方法、跨学科生态毒理学信息的处理方法等。期刊主要研究方向包括：环境化学、生态毒理学、环境修复、风险评估等。

根据科睿唯安发布2023年度期刊引证报告，Environmental Chemistry and Ecotoxicology首个影响因子为9.0，在ENVIRONMENTAL SCIENCES和Toxicology学科领域均位于Q1区。《2025年中国科学院文献情报中心期刊分区表》正式发布，Environmental Chemistry and Ecotoxicology 荣列大类：环境科学与生态学1区，Top期刊；小类：ENVIRONMENTAL SCIENCES 环境科学1区；TOXICOLOGY 毒理学1区。