亲和体分子是一种具有高亲和能力的非免疫性蛋白，可以特异性地靶向肿瘤细胞表面过表达的细胞因子。然而，由于亲和体在体内半衰期相对较短，严重限制了其在靶向药物中的应用。在本文中，两亲性亲和体-药物偶联物通过自组装形成纳米胶束以延长药物体内循环时间，采用靶向治疗策略治疗HER2阳性卵巢癌和乳腺癌。 Self‑Assembled Nanomicelles of Affibody‑Drug Conjugate with Excellent Therapeutic Property to Cure Ovary and Breast Cancers Xuelin Xia, Xiaoyuan Yang, Wei Huang, Xiaoxia Xia*, Deyue Yan*
Nano-Micro Letters (2022)14: 33
https://doi.org/10.1007/s40820-021-00762-9
1. 具有靶向作用的纳米胶束Z-MADCN 。2. 优异的抗肿瘤性能 ，可以消除体积约为100 mm3和500 mm3的实体瘤，其肿瘤抑制率达99.8%，并且该纳米药物在体内具有很好的生物安全性。
乳腺癌和卵巢癌一直是世界范围内导致女性死亡率最高的两类癌症。研究证实人皮生长因子受体2 (HER2)是一类酪氨酸激酶受体家族成员中的一员，在许多癌症如乳腺癌和卵巢癌中存在过表达现象。在过去的几十年中，针对HER2受体的单抗和抗体-药物偶联物(ADC)技术已经被成功开发。该技术通过抗体作为载体将细胞毒素通过靶向递送作用选择性递送到肿瘤部位，有效提高了细胞毒素的抗肿瘤作用。但ADC药物依然存在不足之处，如抗体尺寸大，制备过程复杂，药物偶联位点的不确定性及对实体瘤的组织穿透性差等问题。为解决以上问题，上海交通大学颜德岳教授课题组和夏小霞教授课题组，提出采用亲和体蛋白与疏水药物毒素偶联制备亲和体-药物偶联物并采用自组装策略制备主动靶向纳米药物以改善ADC药物的不足。因亲和体-药物偶联物ZHER2:342-MMAE的两亲性质使其在水溶液中成功组装形成120 nm左右的纳米胶束，组装后的纳米胶束依然保持亲和体蛋白的高亲和性能。在HER2阳性卵巢癌(SKOV-3)和乳腺癌(BT474)肿瘤模型小鼠中，Z-MADCN纳米药物在两种肿瘤模型中均获得优异的抗肿瘤性能，肿瘤抑制率高达99.8%，小鼠的肿瘤全部被治愈无复发，并且纳米药物在小鼠体内具有很高的生物安全性。
亲和体蛋白N端的巯基与海图毒素的Linker马来酰亚胺基团通过迈克尔加成方法制备亲和体-药物偶联物ZHER2:342-MMAE，该偶联物的分子量为8438.14。在水溶液中该偶联物自组装形成胶束大小为120 nm左右的胶束结构。自组装形成纳米胶束Z-M ADCN依然保持了ZHER2:342亲和体的高亲和性，其亲和性大小约为6.44×10⁻⁹ M。
图1. (a, b) ZHER2:342亲和体蛋白及ZHER2:342-MMAE偶联物的MALDI-TOF质谱图；(c, d) ZHER2:342-MMAE自组装形成纳米胶束Z-M ADCN的DLS图和TEM图；(e, f) ZHER2:342亲和体蛋白及Z-M ADCN分别与HER2受体胞外区域ECD之间的亲和性检测。 II Z-M ADCN体外性能评价
采用激光共聚焦显微镜对SKOV-3细胞摄取Z-M ADCN情况进行观测，结果显示：随着孵育时间的延长，Z-M ADCN很容易被SKOV-3细胞摄取进入到肿瘤细胞内，并且通过阻断实验证实Z-M ADCN通过HER2受体介导的内吞作用进入胞内。Z-M ADCN在HER2阳性细胞SKOV-3及BT474细胞中具有很好的生物活性，其IC₅₀值分别为3.64 nM和8.08 nM。相较于HER2阴性细胞MDA-MB-231 (>100 nM), Z-M ADCN在HER2阳性细胞中具有更低的IC50，Z-M ADCN可以靶向HER2受体实现在细胞层面上的靶向递送。 图2. Z-M ADCN体外性能研究。(a) SKOV-3细胞与Cy5.5标记的Z-M ADCN共孵育不同时间(0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h)后的激光共聚焦照片，细胞核采用Hoechst33342染色；(b) SKOV-3细胞提前采用与Cy5.5标记的ZHER2:342亲和体预孵育1h后采用Cy5.5标记的Z-M ADCN共孵育4h后的CLSM照片；(c) MDA-MB-231细胞与Cy5.5标记的Z-M ADCN共预孵育4h后的CLSM照片；(d, e, f) MMAE及Z-M-ADCN在SKOV-3, BT474和MDA-MB-231细胞的体外细胞毒性测定；(g) 流式细胞仪检测MMAE及A-M-ADCN与SKOV-3细胞共孵育后的细胞凋亡率。 亲和体分子因其分子量较小，容易在体内清除。相较于亲和体，自组装形成的Z-M ADCN具有一定的纳米尺寸，有利于延长在体内的血液循环时间。基于此，我们采用SD大鼠研究Z-M ADCN在体内的药代动力学情况。结果表明Z-MADCN在体内的清除速率明显降低，其体内半衰期明显长于ZHER2:342亲和体在体内的半衰期。进一步地，在近红外荧光成像中显示Cy5.5标记的Z-M ADCN更容易在肿瘤部位富集，且在肿瘤部位滞留时间明显增长。这些结果证明Z-M ADCN具有巨大的靶向治疗潜力。
图3. Z-M ADCN在SKOV-3荷瘤小鼠体内的分布情况。(a) Cy5.5标记的ZHER2:342亲和体和Cy5.5标记的Z-M ADCN在SD大鼠血浆中浓度随时间的变化情况；(b) Cy5.5标记的ZHER2:342亲和体和Cy5.5标记的Z-M ADCN在裸鼠体内不同时间(1 h, 2 h, 4 h, 8 h)的近红外荧光成像片照片；(c) Z-M ADCN在体内不同时间(1 h, 4 h, 8 h)的组织分布情况。 IV Z-M ADCN在SKOV-3及BT474荷瘤小鼠中的抗肿瘤性能
基于以上Z-M ADCN在体内的靶向性能，作者研究了Z-M ADCN在SKOV-3和BT474为肿瘤模型的荷瘤小鼠中的抗肿瘤性能。结果表明：Z-M ADCN在SKOV-3和BT474荷瘤小鼠中均获得优异的抗肿瘤作用。在100 mm3的的肿瘤，小鼠给药五次之后，肿瘤基本消失且小鼠体重保持不变。除此之外，Z-M ADCN对500 mm3以上的肿瘤也具有很好的治疗效果，在连续给药五次后，小鼠肿瘤均可以消除。相较于MMAE组，Z-M ADCN治疗组具有更好的治疗效果和更高的生物安全性。
图4. Z-M ADCN对SKOV-3肿瘤的体内抗肿瘤效果。(a) Z-M ADCN对对肿瘤体积为100 mm3 SKOV-3荷瘤小鼠的治疗过程；(b, c) SKOV-3荷瘤小鼠治疗过程中体积及体重的变化曲线图；(d, e, f) Z-M ADCN治疗结束后的种瘤体重，治疗结束后小鼠照片及肿瘤照片；(g, h, i) Z-M ADCN对对肿瘤体积为500 mm3 SKOV-3荷瘤小鼠的治疗及给药后肿瘤体积和体重的变化曲线；(j, k, l) 治疗结束后的肿瘤质量，治疗过程中小鼠照片及治疗结束后各组肿瘤组织的H&E染色照片。
图5. Z-M ADCN对BT474肿瘤的体内抗肿瘤效果。(a) Z-M ADCN对对肿瘤体积为100 mm3 BT474荷瘤小鼠的治疗过程；(b, c) BT474荷瘤小鼠治疗过程中体积及体重的变化曲线图；(d, e) Z-M ADCN 治疗结束后的种瘤体重，治疗结束后小鼠照片；(f, g, h) Z-M ADCN对对肿瘤体积为500 mm3 BT474荷瘤小鼠的治疗及给药后肿瘤体积和体重的变化曲线； (i, j, k) 治疗结束后的肿瘤质量，小鼠照片及H&E染色照片。
夏雪霖
本文第一作者
上海交通大学 博士研究生
夏小霞
本文通讯作者
上海交通大学 教授
蛋白材料合成生物学研究。
▍主要研究成果
通过肽段模块的挖掘及重构，仿生及再设计人工蛋白质，在宿主微生物体内构建亚细胞器，对细胞生命活动进行代谢重塑；在体外制备智能仿生及生物医用材料。在Nat Chem Biol等高水平期刊发表论文60余篇。 ▍Email: xiaoxiaxia@sjtu.edu.cn
颜德岳
本文通讯作者
上海交通大学 教授
超分子自组装和抗肿瘤新药研制。
▍主要研究成果
中国科学院院士，上海交通大学讲座教授，高分子科学家。比较系统地发展了聚合反应动力学的非稳态理论，在超支化聚合物的可控合成、超分子自组装和抗肿瘤新药研制方面取得了原创性成果。已经发表论文500余篇，连续多年被Elsevier评为中国高被引学者。获国家自然科学奖三项，何梁何利科技进步奖一项，国家教学成果奖一项。 ▍Email: dyyan@sjtu.edu.cn
Nano-Micro Letters《纳微快报(英文)》是上海交通大学主办、Springer Nature合作开放获取(open-access)出版的学术期刊，主要报道纳米/微米尺度相关的高水平文章(research article, review, communication, perspective, etc)，包括微纳米材料与结构的合成表征与性能及其在能源、催化、环境、传感、电磁波吸收与屏蔽、生物医学等领域的应用研究。已被SCI、EI、PubMed、SCOPUS等数据库收录，2020JCR影响因子达16.419，学科排名Q1区前10%，中科院期刊分区1区TOP期刊。多次荣获“中国最具国际影响力学术期刊”、“中国高校杰出科技期刊”、“上海市精品科技期刊”等荣誉，2021年荣获“中国出版政府奖期刊奖提名奖”。欢迎关注和投稿。 Web: https://springer.com/40820E-mail: editor@nmlett.org
Tel: 021-34207624
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