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做完qPCR实验，拿到一堆Ct值，很多人会有点懵：这些数字到底是什么意思？怎么判断我的样本是端粒酶阳性还是阴性？

别担心，今天我们就来详细讲讲翼和生物端粒酶检测试剂盒的结果判读方法，教你如何正确解读Ct值。

什么是Ct值？在讲判读之前，我们先简单回顾一下什么是Ct值。

Ct值（Cycle threshold），即循环阈值，是指荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。简单来说，Ct值越小，说明起始模板浓度越高，因为只需要较少的循环就能达到阈值；Ct值越大，说明起始模板浓度越低。

一般来说，Ct值每相差1，模板浓度就相差约2倍（假设扩增效率为100%）。

翼和的试剂盒检测两个基因：TERT基因（FAM通道）和内参基因GAPDH（Cy5通道）。两个基因各有一个Ct值。

第一步：判断实验是否有效拿到结果后，第一步不是看样本，而是先看对照，判断这次实验是否有效。

如果对照都不正常，那样本的结果也就不可信了。

阳性对照的判断标准：

￮        4倍稀释后：TERT基因Ct值在25±3范围内，内参基因Ct值在17±3范围内。

￮        8倍稀释后：TERT基因Ct值在26±3范围内，内参基因Ct值在18±3范围内。

￮        TERT基因和内参基因之间∆CT维持在9±3范围内，保持稳定。

简单理解就是：阳性对照的TERT和内参都应该有正常的扩增曲线，Ct值在预期范围内，而且随着稀释倍数增加，Ct值相应增加，∆Ct保持稳定。

阴性对照的判断标准：

￮        经4倍、8倍梯度稀释后，TERT基因Ct值≥35（或检测不到，即No Ct）。

￮        内参基因Ct值仍在18±3之间。

简单理解就是：阴性对照的内参应该正常扩增，但TERT基因应该没有扩增，或者Ct值很大（≥35）。

空白对照的判断标准：

￮        TERT基因和内参基因都应该检测不到（No Ct）。

空白对照如果出峰了，说明体系有污染，实验结果不可靠。

只有当所有对照都符合标准时，这次实验才是有效的，样本的结果才可信。

第二步：判断样本RNA质量和反转录是否成功实验有效之后，第二步是看样本的内参基因，判断RNA质量和反转录是否成功。

内参基因GAPDH是管家基因，在所有细胞中都应该有表达。如果内参都没出峰，说明RNA降解了，或者反转录失败了，那样本的结果就不可信。

内参判断标准：

￮        待测样本4倍稀释后，内参基因Ct值在14～20之间（或17±3之间）。

￮        扩增曲线正常，呈典型的S型曲线。

如果内参Ct值太小（比如小于12），说明cDNA浓度太高，可能会有抑制作用；如果内参Ct值太大（比如大于22），说明RNA浓度太低或者质量不好，都可能影响结果的可靠性。

第三步：判断样本端粒酶活性阴阳确认实验有效、内参正常之后，第三步就是看TERT基因的Ct值，判断样本的端粒酶活性是阳性还是阴性。

阳性判断标准：

￮        内参基因Ct值在14～20之间（正常）。

￮        TERT基因Ct值＜35。

￮        TERT基因的扩增曲线正常，呈典型的S型曲线。

同时满足这三个条件，就可以判断样本的端粒酶活性为阳性。

阴性判断标准：

￮        内参基因Ct值在14～20之间（正常）。

￮        TERT基因Ct值≥35，或者检测不到（No Ct）。

￮        TERT基因无明显的扩增曲线，或者只有很弱的非特异性信号。

同时满足这三个条件，就可以判断样本的端粒酶活性为阴性。

灰色地带怎么处理？有时候可能会遇到一些"灰色地带"的情况，比如TERT的Ct值在34-36之间，或者扩增曲线不太典型。这时候该怎么判断呢？

建议：

a.       看扩增曲线：Ct值只是参考，更重要的是看扩增曲线的形状。正常的扩增曲线应该是平滑的S型，有明显的基线期、指数期和平台期。如果曲线歪歪扭扭，或者只有很微弱的信号，那很可能是非特异性扩增。

b.      看溶解曲线（如果是SYBR Green法）：如果有溶解曲线，可以看溶解峰是否单一，是否在预期的Tm值位置。不过翼和的试剂盒是TaqMan探针法，一般不需要做溶解曲线。

c.       重复实验：如果结果不确定，建议重复实验验证。有时候一次实验可能有偶然因素。

d.      结合其他信息：结合样本的类型、预期的结果等综合判断。比如正常的间充质干细胞应该是阴性的，如果检测出弱阳性，就要怀疑是不是有污染或者操作问题。

关于定量分析翼和的试剂盒不仅可以定性判断阴阳，还可以进行相对定量分析。

如果你需要比较不同样本之间端粒酶活性的高低，可以用∆Ct法或者∆∆Ct法进行相对定量。

简单来说：

￮        ∆Ct = TERT Ct值 - 内参Ct值。∆Ct越小，说明TERT的相对表达量越高，端粒酶活性越强。

￮        ∆∆Ct = 处理组∆Ct - 对照组∆Ct。然后用2^(-∆∆Ct)计算相对表达倍数。

不过要注意，相对定量的前提是扩增效率一致，而且内参基因的表达稳定。

常见问题

Q：为什么我的样本内参很亮，但TERT没有信号？

A：如果是正常体细胞或者间充质干细胞，这是正常的，因为这些细胞本来就没有端粒酶活性。如果是肿瘤细胞或者阳性对照也没有信号，那就要检查实验操作是否有问题。

Q：为什么我的阴性对照TERT也出峰了？

A：这很可能是污染了。检查一下操作过程中有没有交叉污染，试剂有没有被污染，枪头、离心管等是否无菌无酶。

Q：Ct值的范围一定要严格遵守吗？

A：说明书上的Ct值范围是参考值，是在特定的实验条件下得到的。不同的仪器、不同的试剂批次，Ct值可能会略有差异。关键是看对照是否正常，以及扩增曲线的形状。

总结结果判读三步走：先看对照判断实验是否有效，再看内参判断样本质量，最后看TERT判断阴阳。按照这个流程来，就能正确解读端粒酶检测的结果了。

翼和生物的试剂盒提供了明确的判读标准和详细的操作指导，让你的实验结果解读不再困难。

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