原代细胞传不了几代便走向衰老，向细胞导入hTERT实现永生化，是许多实验室的常规操作。但"转染成功"并不等于"永生化成功"——2024年发表于Int J Mol Sci的一篇综述直言：目前并不存在统一的标准清单来确认永生化是否成功，多数研究者只评估了少数几个参数，不同文献的评估标准还相互矛盾。永生化细胞介于原代细胞与肿瘤细胞之间，既要无限增殖，又要保持正常核型、表型且无致瘤性——"永生且未变质"，才是真正需要验证的事。

一、为什么hTERT是永生化关键

细胞每分裂一次，染色体末端就会丢失50-200个碱基的端粒DNA；端粒缩短到临界值，细胞便触发DNA损伤应答，进入不可逆的复制性衰老。端粒酶是维持端粒的逆转录酶，由RNA组分hTERC和催化亚基hTERT组成——hTERC在成体大多数细胞中都有表达，而hTERT仅见于生殖细胞、增殖干细胞和肿瘤细胞。正因如此，向原代细胞导入外源hTERT、重建端粒维持能力，成为最常用的永生化策略。不过外源基因转染效率通常只有5%-10%，筛选后的细胞是否真正"过关"，还须系统验证。

二、永生化细胞的"验收清单"

ATCC目录中的hTERT永生化细胞系均需通过四项检测：扩展增殖能力、核型稳定、组织相关表型标记以及持续的hTERT表达。该综述进一步建议，完整评估还应涵盖细胞形态、增殖速率、端粒酶活性、细胞特异性标记物与致瘤性；其中连续培养50-70代甚至100代以上，被视为判定永生化最可靠、也最耗时的标准。值得注意的是，增殖速率异常加快反而提示危险——该综述援引的研究显示，hTERT联合SV40大T抗原永生化的人成纤维细胞增殖速度达正常两倍并出现染色体异常，提示细胞正在走向恶性转化而非单纯永生化。

三、hTERT检测：测对方法，比"测了"更重要

争议最大的是hTERT表达水平的检测。综述指出，不同实验室用不同引物会得到截然不同的结果：许多引物对设计在逆转录酶结构域（外显子5-10），不覆盖外显子1-4和11-16，因而能在端粒酶阴性的细胞中检出"hTERT转录本"——那其实是非全长mRNA，根本无法产生有活性的端粒酶。hTERT还存在多种天然剪接变体，其中一些没有端粒酶活性，却能刺激细胞增殖。换句话说，hTERT测出来的值高不高，首先取决于你有没有"测对"。严谨的定量方案早有先例：美国NIST完成的hTERT mRNA定量分析验证显示，用特异性引物与探针可在10-7000个细胞/反应的范围内实现定量，并与端粒酶活性检测联用以提升通量。而TRAP法本身也有门槛：需以永生化前的亲本细胞为阴性对照、以高活性癌细胞系为阳性对照，活性差异多少算"合格"，至今没有既定标准。

四、永生化细胞的价值与风险

永生化细胞的价值不止于实验室工具。间充质干细胞（MSC）体外扩增受Hayflick极限限制，hTERT永生化MSC则可无限扩增、消除供体异质性，正成为细胞治疗与细胞外囊泡生产的重要细胞来源；但永生化伴随的基因改变也带来恶性转化风险，长期培养必须持续监控。

五、给永生化实验的质控建议

永生化确认是一场多指标"组合考"：核型、形态、标记物之外，端粒酶/hTERT状态是绕不开的核心项；检测hTERT表达须选择引物与探针经过严谨设计的方案，以避开剪接变体和非全长转录本带来的假信号；qPCR平台成熟、定量准确、样本可长期保存，是兼顾效率与可靠性的务实之选。

翼和生物端粒酶活性qPCR检测试剂盒，基于hTERT mRNA表达定量技术路线，采用双色荧光TaqMan探针qPCR法，特异性强、定量准确、操作便捷，为永生化细胞确认、细胞系质控及端粒酶相关研究提供可靠工具支持。

参考文献：

1. Shitova M, Alpeeva E, Vorotelyak E. Review of hTERT-Immortalized Cells: How to Assess Immortality and Confirm Identity. Int J Mol Sci. 2024 Dec 4;25(23):13054. doi: 10.3390/ijms252313054.

2. Jakupciak JP, Wang W, Barker PE, Srivastava S, Atha DH. Analytical validation of telomerase activity for cancer early detection: TRAP/PCR-CE and hTERT mRNA quantification assay for high-throughput screening of tumor cells. J Mol Diagn. 2004 Aug;6(3):157-65. doi: 10.1016/S1525-1578(10)60506-5.

3. Yamaguchi N, Horio E, Sonoda J, et al. Immortalization of Mesenchymal Stem Cells for Application in Regenerative Medicine and Their Potential Risks of Tumorigenesis. Int J Mol Sci. 2024 Dec 18;25(24):13562. doi: 10.3390/ijms252413562.

支持单位：