三维超分辨显微成像技术凭借纳米级分辨率与活细胞兼容性，已成为突破光学衍射极限、解析生命微观机制的关键工具。复旦大学孔令豹教授团队特邀综述聚焦受激发射损耗（STED）显微术、单分子定位显微（SMLM）术与结构光照明显微（SIM）术三大主流技术，系统阐述了相关成像原理与发展历程，重点剖析了在空间分辨率、成像速度、深度及多技术融合方面的最新突破，并探讨了深度学习在图像重构中的革命性作用，为相关领域提供了清晰的技术发展路线图。

文章来源：高梓晗, 凌羽溪, 吴佳兴, 谢常笑, 刘宏超, 孔令豹. 三维超分辨显微成像技术及研究进展[J]. 光学学报（网络版）, 2026, 3(01): 0105001.

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研究背景

自17世纪以来，光学显微技术一直是生命科学研究的核心工具，但其观测能力长期受制于“阿贝衍射极限”。传统光学显微镜的横向分辨率被限制在200~250 nm，轴向分辨率约为500~600 nm，这使得突触囊泡、病毒颗粒、染色质折叠等关键亚细胞结构因尺寸过小而无法被清晰分辨，从而在光学显微镜与电子显微镜之间形成了一道“分辨率鸿沟”。

20世纪90年代，超分辨荧光显微技术的诞生打破了上述物理瓶颈。Stefan Hell、William Moerner与Eric Betzig因开创STED和SMLM显微技术，利用荧光分子的“开关”特性突破衍射极限，荣获2014年诺贝尔化学奖。这些技术将荧光标记的特异性、活细胞兼容性与纳米级分辨率相结合，使科学家们终于能够在分子尺度上直接观察生命过程。

然而，生命活动本质上是立体的，细胞器与分子的功能与其三维结构紧密相关。随着生物学研究向更深维度探索，现有技术面临诸多挑战：捕捉快速移动的细胞器需要更快的成像速度，解析脑组织等厚样本需要更深的穿透深度，而长时程观察则要求极低的光毒性。因此，如何将单一性能的优化统一到三维成像框架下，并结合深度学习算法提升图像重构的质量与速度，成为当前光学工程与生物医学交叉领域的关键研究方向。

图1 超分辨技术相关论文发表数量

关键技术及发展

• STED显微技术及其发展历程

受激发射损耗显微技术是光学成像领域的革命性突破，它通过确定性的物理机制绕开了光学衍射极限，将分辨率推进至纳米尺度；其核心原理在于“激发-损耗”过程：首先使用激发光使分子进入激发态，随即利用一束中心光强为零的“甜甜圈”状损耗光，通过受激发射强制将激发光斑外围的分子“熄灭”回基态。这一过程有效压缩了点扩散函数（PSF），仅保留中心极小区域的荧光发射，从而实现超高分辨率成像。

近年来，STED技术在精度、速度、深度及低光毒性方面取得了重大突破：MINSTED技术结合了STED与单分子定位思想，利用损耗光作为探针搜寻分子，以极低的光子数实现了埃米级的定位精度；为降低光毒性，Event-triggered STED系统实现了“智能”成像，仅在检测到特定生物事件时才开启高分辨率扫描。同时，深度学习被用于低信噪比图像的复原，允许在极短曝光下成像，显著提升了成像速度；针对厚组织成像，研究人员集成了自适应光学（AO）与双光子激发技术，成功在小鼠脑组织深处实现了高分辨率成像。

图2 蓝移MINSTED技术。(a) 荧光团Cy3B的定性荧光与吸收光谱；（b）蓝移圆环波长（下部圆环波长更短）可使STED显微镜的有效PSF中心峰变尖锐；（c）MINSTED仅有一个荧光团处于活跃状态，可以忽略背景（右图）；（d）MINSTED装置示意图

总体而言，STED技术正朝着更温和、更快速、更深层的方向发展，并开始与其他技术（如扩展显微镜ExM）融合，有望成为解析亚细胞精细结构与动态过程的强大工具。

• SMLM显微技术及其发展历程

单分子定位显微成像技术通过只随机激活样品中极少数、彼此相互分离的荧光分子进行探测定位，其由于发光分子的PSF不发生重叠，能够对发光分子中心位置高精度拟合，实现纳米级分辨率。根据不同的荧光探针与光激活技术，SMLM可分为以光激活荧光蛋白为荧光探针的光激活定位显微技术（PALM），和采用“报告染料”与“激活染料”组成的双组有机染料体系的随机光学重建显微技术（STORM）。近年来，一种基于分子动力学的DNA-PAINT技术也被提出。

在三维成像的发展进程中，SMLM最初通过PSF工程法提取轴向信息，例如利用柱面镜引入像散，使PSF形状随深度发生椭圆变化，从而实现约50~60 nm的轴向分辨率。为了进一步提高精度，双物镜干涉技术（如iPALM）被引入，随后发展的4Pi-STORM技术结合动态样条PSF建模，通过全方位波前干涉将轴向分辨率提高至10~20 nm，实现了近乎各向同性的纳米级成像。随着对三维超分辨成像需求的不断增长，以及高密度样本分析、多靶标成像和活细胞成像等复杂应用场景的出现，三维SMLM技术面临着更高的性能要求。MINFLUX技术通过结合结构光照明极小值与单分子定位，以极少的光子数实现了亚5 nm的定位精度。针对传统SMLM成像速度慢的瓶颈，基于深度学习的高密度定位算法（如DECODE）应运而生，该算法能够从重叠的荧光信号中准确分离分子，大幅提高时间分辨率。此外，SMLM结合AO与倾斜光片照明（soTILT3D）的策略，有效克服了深层组织中的像差与背景噪声，使其应用逐渐从单层细胞拓展至活细胞动力学及厚组织微结构的精细解析。

图3 三维SMLM光路示意图。（a）相差法；（b）双螺旋PSF法；（c）平面法；（d）干涉法

• SIM显微技术及其发展历程

与需逐点扫描的STED和随机稀疏激发的SMLM不同，传统SIM利用莫尔条纹效应通常仅需几或十几种结构光场照射物体，并通过算法对物体进行重建，大大提升了成像速度（毫秒级）。作为宽场荧光显微镜的延伸，SIM可将其三个维度空间分辨率提高一倍。此外，利用荧光标记物对激发光的非线性响应产生更高次谐波，原则上可使非线性SIM的分辨率提升不受限制；凭借其高效的光学切片能力、普适的荧光标记物与出色的低光毒性，SIM在活体细胞及细胞器动态等研究中大放异彩。

继2008年I⁵S成像架构通过双物镜相干收集照射物体后的六光束干涉光场、实现三维各向同性的100 nm分辨率后，2024年4Pi-SIM在其基础上拓展双色同步成像模式用来捕捉相连细胞器间的快速作用。同时，为实现厚度超过单个细胞样本的三维成像，SIM引入多焦点激发与探测、AO与随机照明等方案，用以克服光学像差导致的分辨率损失和伪影；如基于随机照明提出多重散斑照明，并将扩展景深方法与SIM结合，使光轴上所有物体清晰成像，其轴向PSF从0.65 μm扩展至1.6 μm，焦平面扫描深度最高约20 μm，如图4所示。近年来，又发展出一类基于点扫描结构光的SIM技术，如通过结合共聚焦扫描与宽场再投影的iSIM技术、利用多焦点阵列同时进行结构化激光扫描的MSIM，成为SIM技术中非常重要的一类。

图4 扩展景深随机照明显微镜的系统示意图。（a）系统示意图；（b）采样序列的时间方案；（c）（d）照明斑点示例；（e）不同显微镜对比

• 计算成像方法在超分辨显微成像中的应用

在上述三维超分辨显微成像技术中，从原始数据到图像分析都需要高效且精准的算法实现。三维成像常伴随复杂的混合噪声与离焦背景，基于深度学习的方法（如Noise2Noise架构）可在毫秒内去除泊松-高斯混合噪声，显著提升图像信噪比。此外，深度增加会导致球差等轴向像差变得显著，使得PSF在不同深度发生变化，算法（如CAO-SBD）可非侵入式地从实验数据中提取真实PSF，并在无需额外硬件校正的情况下，通过计算AO策略补偿像差，恢复清晰的结构信息。在重建三维图像中，通过算法改进可进一步提升分辨率，深度学习不仅可以通过零样本学习（Zero-shot learning）等框架实现瞬时超分辨重建，还能利用内容感知插帧技术（CAFI）提升时间分辨率，缓解光毒性。此外，端到端的计算方法（如Nellie算法）实现了对亚细胞结构的自动化分割与动力学追踪，将成像从单纯的“观测”转化为定量的“分析”。

总结与展望

本文综述了国内外三维超分辨显微成像技术的发展概况，重点介绍了三大主流技术的空间分辨率、成像速度、成像深度、视野范围及重建分析算法的最新突破，并对其未来发展与应用前景进行展望。近三十年间，三维超分辨显微技术在分辨能力上的不断革新为生物研究、临床诊断等领域带来了宝贵的技术支持。三维超分辨显微技术的未来发展，将聚焦当前及潜在生物学研究需求，强调跨领域多方人员协作，一方面借助光学、算法及材料学手段改进成像技术，另一方面应用显微技术定量探究生物医学问题，针对复杂生物样品，协同多种技术的高定位精度转化为超分辨生物医学成像场景，让技术创新扎根于多元实际需求，持续推动生物医学、材料科学等领域研究突破与科研成果的产业化。

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