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NgAgo你做出来了吗 精选

已有 25787 次阅读 2016-8-17 21:36 |系统分类:海外观察| 韩春雨, NgAgo

博主八月九号看到NgAgoprotocol(翻译成中文叫什么来着?),马上就手痒按新protocol做了一遍。需要指出的是,NgAgo不是博主的课题,博主不需要靠这个发文章,就是关注这个事情来着。博主向来非常尊重任何人的protocol,即使不认同,也会严格照做。但毕竟实验室不同,完全一样的条件的实验条件很难保证。并且博主明天就要回国学术交流去了,时间非常紧凑。但这次实验,博主可以保证以下几个传说中很重要实验条件是达到了,1)确定细胞无污染;2)无EDTA,并加了Mg2+


先说结论吧,博主没有看到基因敲除。有人说博主,你做出来了说明韩水平高,做不出来说明你水平不够,何苦呢。还有有热心人向博主透露,韩的NgAgo是有用的,尽管他的文章里结论未必对,但可以看到1%左右的敲除(但博主没有看到数据,所以无从确定)。NgAgo这件事,大家看到国外的科学家不管观点怎样,至少敢贴数据。讨论的时候呢,也是只谈数据,不论个人人品。博主非常欣赏这种科研文化。所以,也来贴一贴。


首先,博主把自己的细胞送到德国的GATC公司检测是否有支原体污染。两天后,结果就出来了 clean. 还给发了一个证书。



同时,博主也准备好了细胞,马上按着protocol做。以下是博主的T7EI结果。




博主用了公司合成的和自己T4 PNK (biolab)磷酸化的gDNA;两种不同的转染方法,Lipofectamine 2000和钙磷法;看了两个不同的基因位点,CCR5AAVS1。红箭头是预期的产物条带。不幸的是,博主都没有看到NgAgo基因组水平的敲除。必须指出,博主用的是实验室现有的DNAase/RNAase-free的水,不确定PH是多少;博主也没有荧光标记的ssDNA,不知道gDNA转染效率怎样;也没有来得及用Fragment analyzer看看的gDNA的纯度怎样。


总而言之,NgAgo不像CRISPR一样,轻轻松松就能做出来的 - 如果有人能做出来的话。好了,博主要收拾行李去了。




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