图1，不同造血阶段增强子对Zeb2基因的调控。

造血过程（Hematopoiesis）是指由造血干细胞（Hematopoietic stem cells, HSCs）及其他前体细胞分化派生出整个血细胞系统的过程。哺乳动物的造血大致分为胚胎造血(Embryonic hematopoiesis)和成体造血(Adult hematopoiesis)两个阶段。早期的胚胎造血只能分化出血红细胞和巨噬细胞等有限的几个群系，而源自HSC的成体造血则几乎可以分化出血细胞系统中的所有群系。HSC和前体细胞的分化受到细胞内基因表达水平的严格调控，而转录因子（Transcription factors, TFs）则通过结合DNA序列上的增强子（Enhancer）来直接控制基因表达。不同群系的细胞中增强子活性不一，最终导致群系特异性的基因表达和细胞的定向分化。那么，同一个基因在不同的造血阶段中会不会被不同的增强子调控？这一问题人们尚无法给出明确解答。

Zeb2基因对造血过程和免疫系统的发育与功能至关重要。HSC分化成为浆细胞样树突状细胞（Plasmacytoid dendritic cells, pDCs），单核细胞 （Monocytes），以及B淋巴细胞的过程都需要Zeb2的表达【1】。而自然杀伤细胞（Natural killer cells, NK cells）和T淋巴细胞的终端分化和成熟也需要这一基因【1】。但是迄今为止，人们尚不清楚这样一个对多个免疫细胞群系至关重要的基因，在免疫细胞的分化过程中是被哪些增强子调控的。

作者团队2019年发表于Nature Immunology杂志上的论文中，首次发现了由Nfil3，Id2和Zeb2三个基因构成的转录调节回路【2】。在这个回路中Nfil3和Id2通过调节Zeb2的表达水平来控制树突状细胞（Dendritic cells, DCs）前体细胞的分化。然而，ID2蛋白并不能直接结合Zeb2序列上的增强子，这意味着ID2对Zeb2基因的调控是间接的，而ID2的靶点——E-蛋白转录因子家族 （E-proteins family transcription factors）很可能在造血过程中直接结合Zeb2的增强子并调控其表达。

在2021年发表的论文中，为了进一步研究Zeb2表达调控的分子机制，作者首先分析了已发表的染色体免疫共沉淀测序（ChIP-seq）数据，并发现位于Zeb2基因转录起始点（Transcription start site，TSS）上游165kb的增强子（-165kb enhancer）可以结合E-蛋白。基于CRISPR技术的体外基因编辑实验显示，在小鼠基因组上删除-165kb增强子可以阻止从小鼠骨髓中提取的前体细胞发育成为pDC。这意味着Zeb2在DC前体细胞中的表达需要完整的-165kb增强子。

为了进一步研究-165kb增强子在体内的功能，作者利用CRISPR基因编辑技术建立了缺失-165kb增强子的小鼠模型（Zeb2Δ-165 小鼠）。与野生型（Wild type， WT）小鼠相比，Zeb2^Δ-165小鼠完全丧失了pDC和单核细胞发育的能力，同时B细胞的数量大幅下降。事实上，在Zeb2^Δ-165小鼠的HSC内完全检测不到Zeb2的表达水平，而WT小鼠中HSC则表达中等水平的ZEB2蛋白。这表明源自HSC的成体造血过程中，Zeb2基因的表达都受到-165kb增强子的调控。

尽管单核细胞的发育在Zeb2^Δ-165小鼠中完全消失，与单核细胞关系紧密的组织驻留型巨噬细胞（Tissue resident macrophage, RTM）的发育却并未受到影响。成年小鼠体内的RTM多数来自胚胎造血，由卵黄囊中的巨噬细胞（Yolk sac macrophages）和胚胎肝单核细胞 (Fetal liver monocytes)发育而成。在成体小鼠中，在某些特殊条件下，血液中由HSC发育而成的单核细胞也可以分化成RTM【3】。

以往研究表明，RTM的功能及发育也需要Zeb2【4】。作者对脾脏内的RTM进行了Zeb2 mRNA的逆转录定量PCR（qRT-pCR）分析，并发现Zeb2^Δ-165小鼠脾脏RTM内的Zeb2 mRNA水平与WT小鼠并无显著差异。这些数据证明Zeb2^Δ-165小鼠体内的RTM并不是在成体造血过程中由HSC发育而成的，且-165kb增强子对Zeb2基因在这些细胞中的表达也不必要。

为了进一步探究Zeb2在巨噬细胞内的调控机制，作者对早期造血过程中的卵黄囊巨噬细胞和胚胎肝单核细胞进行了分析。Zeb2^Δ-165小鼠的卵黄囊巨噬细胞发育完全正常，胚胎肝单核细胞虽然相比WT小鼠有所减少，但是其ZEB2蛋白表达水平与WT小鼠并无显著差异。这表明，在胚胎造血过程中，Zeb2基因的表达是由-165kb增强子以外的一个增强子驱动的。

为了找到这个增强子，作者对来自胚胎和成体的巨噬细胞和单核细胞进行了染色质开放性测序分析（ATAC-seq）。数据表明，-165kb增强子在上述几个群系中均具有活性，但是一个位于Zeb2基因TSS下游164kb的增强子（+164kb enhancer）则只在卵黄囊巨噬细胞和胚胎肝单核细胞中具有活性，在由HSC发育而成的成体单核细胞内则没有活性。同时，对一些在胚胎巨噬细胞和单核细胞内特异性表达的转录因子（如NUR77和LXRα）的ChIP-seq分析也表明这些转录因子可以结合在+164kb增强子上。

这些结果提示，很有可能正是这些只在胚胎巨噬细胞和单核细胞内表达，而不在成体单核细胞内表达的转录因子结合在+164kb增强子上，并驱动了胚胎细胞内Zeb2基因的表达，使得在这些细胞内，即使-165kb增强子缺失，Zeb2也可以正常表达。

最后，为了进一步研究-165kb增强子调控Zeb2表达的分子机制，作者对WT和Zeb2^Δ-165小鼠的脾脏巨噬细胞进行了Hi-C分析。Hi-C实验可以获得细胞内染色质的3D结构。数据表明，Zeb2基因的启动子（Promoter）与-165kb增强子和+164kb增强子之间都有相互作用，而删除-165kb增强子后，Zeb2的启动子与上游大量增强子之间的相互作用大大减少，却并不影响其与下游+164kb增强子之间的作用。这表明-165kb增强子对维护Zeb2基因上游染色质结构至关重要。

综上所述，作者利用基因编辑小鼠模型和一系列高通量测序的实验手段，发现了调控Zeb2基因的两个增强子，其中+164kb增强子可能在胚胎造血过程中调控Zeb2表达，而-165kb增强子则在成体造血过程中支持Zeb2的表达。-165kb增强子对于免疫细胞的分化有着不可或缺的作用。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.04.015

参考文献