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NBT：线虫的工程细菌共生体提高对西方玉米根虫的生防潜力
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线虫的工程细菌共生体提高西方玉米根虫的生物防治潜力
Engineering bacterial symbionts of nematodes improves biocontrol potential of the western corn rootworm
Nature Biotechnology [IF:31.864]
2020-02-17 Articles
DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-020-0419-1
全文可开放获取 https://www.nature.com/articles/s41587-020-0419-1
第一作者和通讯作者：Ricardo A. R. Machado1(e-mail: ricardo.machado@ips.unibe.ch)
其他作者：Lisa Thönen, Carla C. M. Arce, Vanitha Theepan,Fausto Prada,Daniel Wüthrich,Christelle A. M. Robert,Evangelia Vogiatzaki,Yi-Ming Shi,Olivier P. Schaeren,Matheus Notter,Rémy Bruggmann,Siegfried Hapfelmeier,Helge B. Bode and Matthias Erb
作者单位：
1 瑞士伯尔尼大学植物科学研究所(Institute of Plant Sciences, University of Bern, Bern, Switzerland)
摘要
西方玉米根虫（western corn rootworm, WCR） 大批致死了全世界的玉米。控制这种害虫的一种潜在方法是用昆虫病原线虫（entomopathogenic nematodes, EPNs） 进行处理，EPNs中含有对昆虫致病的共生细菌。然而，WCR幼虫能够隔离玉米产生的苯并恶唑嗪酮类次生代谢物，并利用它们增强对线虫及其共生菌的抗性。在此，我们通过试验进化并选择耐苯并恶唑嗪酮类化合物的共生细菌来提高线虫-细菌共生体杀死WCR幼虫的能力。我们从不同线虫中分离出5个Photorhabdus共生体，并通过试验进化提高了它们对苯并恶唑嗪酮类化合物的抗性。这种抗性通过多种机制进化而来，包括类水通道蛋白通道基因aqpZ中的突变。我们将耐苯并恶唑嗪酮类化合物的Photorhabdus菌株重新引入其原始EPN宿主中，并鉴定出一对线虫共生对，它们能够更有效地杀灭隔绝苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫。我们的结果表明，对细菌共生菌的修饰可能为改善农业害虫的生物防治提供一条通用的策略。
相关资料
西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifer, WCR)适应性很强,是侵入性害虫,美国玉米种植带最重要的害虫。目前,此害虫的防治费用及所造成的玉米损失每年达十几亿美元。WCR是一化性昆虫,以卵在土壤中越冬(昆虫在一年间繁殖的代数叫做“化性”，一化性即一年繁殖一代),在晚春到早夏期间孵化为幼虫,幼虫取食禾本科植物根部,特别是玉米。被危害的玉米植株倒伏,产量下降。
昆虫病原线虫(EPN)：寄生于昆虫并使之致病或死亡的线虫。昆虫的病原线虫，在控制昆虫种群数量上起着一定的作用。以昆虫病原线虫防治害虫的试验主要包括两方面：①利用索线虫防治蝗虫等农林害虫。此类线虫侵入害虫体内后，夺取寄主营养，待发育到成熟前期时，从寄主腹腔自行脱出进入土壤或水域中，从而导致害虫死亡。②利用斯氏线虫科和异小杆线虫科种类防治鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、等翅目、直翅目、同翅目、半翅目等害虫。此类线虫是与细菌共生的种类，易于体外大量繁殖。线虫幼虫侵入寄主后能诱发细菌性败血病以杀死害虫，但虫死不腐烂。线虫幼虫从死了的寄主里爬出后，又可找寻新的寄主。在实验室内可用大蜡螟幼虫等材料作为繁殖寄主。【总结：①夺取营养；②靠共生细菌搞死昆虫】
苯并恶唑嗪酮(benzoxazinoids,BXs)是植物体内一种重要的次生代谢物, 因其具有防御作用和化感作用得到了广泛的关注和研究。来源于色氨酸
http://blog.sciencenet.cn/blog-3158122-1165404.html The ISME Journal：苯并噁唑嗪酮调控玉米根与微生物的互作。化感物质：植物的次生代谢产物，是生物体内产生的非营养性物质，包含酚类、萜类、生物碱和非蛋白氨基酸等。
化感作用：植物释放的化感物质可以通过挥发、淋溶、根系分泌和残茬降解等途径进入环境中，对另一种植物所产生的直接或间接的伤害作用。生态农业就是充分利用植物的化感作用，在生产中不使用农药、除草剂和高浓度等比例化肥，而是用生态方法使作物产生化感物质，减少投入，同时获得优质的农产品。
【拟寄生物】(Parasitoid)，也称类寄生生物或捕食寄生生物，是指幼虫期寄生宿主体内，后期将宿主杀死，成虫营自由生活的生物。“拟寄生”是一种介于寄生和捕食之间的中间关系。寄生蜂就属于一种拟寄生昆虫。拟寄生物可以用来进行害虫的生物防治。
引言
多细胞动植物的细菌共生体通过合成有助于食物消化和解毒的必需养分，获取和回收养分，提供对病原体和寄生虫的抵抗力以及增强胁迫耐受性从而有助于宿主功能。考虑到这些功能，有人提出可以通过设计细菌共生体来改善宿主的生物医学和农业功能。迄今为止，细菌共生体主要通过定向接种或移植应用于生物医学和农业问题。例如，已证明向大豆田接种固氮根瘤菌可以增加大豆产量。尽管有报道称工程共生体可以改善生物技术功能，但这种方法的潜力仍未被充分开发。
昆虫病原线虫(EPNs)是一种以昆虫为食，与致病菌共生的土居线虫。线虫的肠道中有细菌共生体。当攻击昆虫时，线虫将细菌释放到昆虫血腔中。然后，共生细菌通过释放杀虫的次级代谢产物、裂解酶和免疫抑制剂来杀死昆虫并对其进行预消化。线虫寄主以液化的昆虫组织为食，繁殖，重建与细菌的共生关系，然后转移到新的寄主中。Heterorhabditis bacteriophora，一种携带Photorhabdus共生菌的EPN，可有效杀死多种昆虫，被用作农业的生物防治剂。
昆虫可以通过细胞和体液的先天免疫应答来抵抗线虫的侵害。一些食草性昆虫也可以积聚源于植物的化感物质来防御。西方玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera virgifera)就是这种情况，它是世界上最具破坏力的玉米害虫之一。WCR每年造成的直接经济损失超过20亿美元，并且已经侵袭了全球超过5,000万公顷的玉米。WCR之所以能成为如此成功的玉米害虫，原因之一是它具有利用玉米防御代谢产物的能力。WCR幼虫利用玉米的次生代谢产物在根际定位，以识别其寄主植物最有营养的根，并优化其养分摄取。我们的研究表明WCR积累了玉米苯并恶唑嗪酮类化合物，从而增加了其对市售H. bacteriophora EPNs28的抗性。增强的抗性与两种不同的机制有关：
WCR幼虫释放6-甲氧基-2-苯并恶唑嗪酮 N-葡萄糖苷 (MBOA-Glc)，它能击退线虫。
WCR在线虫攻击时积累2-羟基-4,7-二甲氧基-1,4-苯并恶嗪-3-oneO-葡萄糖苷(HDMBOA-Glc)并释放分解产物6-甲氧基-2-苯并恶唑啉酮(MBOA)。
HDMBOA-Glc和MBOA均会降低线虫及其Photorhabdus细菌共生体的存活率。相对于缺乏苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫，累积苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫对H. bacteriophora的感染性可降低50%以上。
我们报道了与WCR具有相同进化历史的线虫进化出了对苯并恶唑嗪酮类化合物的抗性。我们假设通过产生耐苯并嗪类抗性共生体有可能提高EPNs对WCR的疗效。由于苯并恶唑嗪酮类化合物抑制Photorhabdus生长的机制尚不清楚，因此我们采用定向进化的方法培育出了耐苯并恶唑嗪酮类化合物的Photorhabdus菌株。我们将耐药菌株重新导入到它们原来的EPN宿主中，并评估它们杀灭WCR幼虫的能力，以确定是否可以通过靶向工程改造共生细菌来提高生物防治剂的功效。
结果
Photorhabdus 菌株的MBOA抗性
MBOA resistance in Photorhabdus strains
一旦被EPNs感染，WCR幼虫将HDMBOA-Glc转化为MBOA。MBOA降低了Photorhabdus共生体的生长，这可能会降低其线虫宿主的攻击性。因此，我们将MBOA抗性作为Photorhabdus的目标特征，以提高EPN-细菌共生体对WCR幼虫的杀灭效果。首先，我们分离出了Photorhabdus共生体(图1)。然后，通过测量细菌在不同MBOA浓度下的生长来分析它们对MBOA的抵抗力(图2)。MBOA以剂量依赖性方式减少了所有测试菌株的生长。三个菌株(Photorhabdus laumondii subsp. laumondii EN01,P. laumondii subsp. Laumondii IL9和P. laumondii subsp. laumondii TT01)对MBOA更敏感，在约140 μg ml-1的MBOA浓度下，它们的生长减少了50％(一半的最大生长抑制，GI50)。两个菌株(Photohabdus bodei CN4和Photohabdus kayaii HU2)在MBOA浓度约为240 μg ml-1时具有更高的抗性并显示出相同的生长减少。生长动力学分析表明，在某些菌株中，MBOA浓度在低至11 μg/mL时会对细菌性能产生负面影响，并且MBOA主要通过降低细胞分裂速率而非细胞建立(cell establishment)来降低细菌生长。这些实验表明，Photorhabdus菌株对MBOA敏感，但敏感性因菌株而不同。
图1 研究系统概述
Overview of the study system
a，以玉米根为食的西方玉米根虫(WCR)幼虫。WCR是一种重要的农业害虫，可以隔离植物苯并恶嗪类化合物，以自防御昆虫病原线虫(EPNs)。
b，携带绿色荧光蛋白标记的Photorhabdus细菌共生菌(黑色箭头)的一种Heterorhabditis bacteriophora EPN。H. bacteriophora通过释放致病性Photorhabdus细菌杀死昆虫。苯并恶唑嗪酮类化合物(对线虫及其细菌共生体均具有毒性)降低了线虫控制WCR的潜力。
c，将Photorhabdus细菌显微注射到WCR中。
d，健康(右箭头)和被Photorhabdus感染(左箭头)的WCR幼虫。线虫攻击或显微注射Photorhabdus细胞后被Photorhabdus杀死的幼虫变红。
图片来源：Cyril Hertz和Lingfei Hu (a)，Catherine Easom和David Clarke (b)和Ricardo A. R. Machado (c,d)。
图2 对MBOA选择增加了不同Photorhabdus菌株的MBOA抗性
Selection on MBOA increases MBOA resistance of different Photorhabdus strains
a，选择Photorhabdus 中具有MBOA抗性的菌株试验进化方法示意图。
b，描述实验经历和本研究中产生的不同菌株的名称。
c-g，初始菌株(进化祖先)、在不含MBOA的LB对照培养基(C-)中选择的菌株及在包含MBOA的LB培养基中选择的菌株(M-)中，抑制细菌生长50%时的MBOA浓度(即GI50)。不同字母表示菌株间在统计学上具有显著差异(采用Holm多重比较检验的双尾方差分析，P <0.05)。EN01(n = 9)，C-EN01(n = 3)，M-EN01(n = 3)；IL9(n = 5)，C-IL9(n = 3)，M-IL9(n = 3)；HU2(n = 5)，C-HU2(n = 3)，M-HU2(n = 3)；TT01(n = 6)，C-TT01(n = 3)，M-TT01(n = 3)；CN4(n = 10)，C-CN4(n = 4)，M-CN4(n = 5)。n表示独立实验的次数。
通过选择MBOA抗性进行定向进化
Directed evolution by selecting for MBOA resistance
我们首先尝试在线虫宿主之间交换菌株，以测试细菌MBOA抗性和线虫感染之间的关系。然而，交换实验被证明是困难的，因为许多线虫和非原生细菌共生体之间的共生关系未能建立。因此，我们使用试验性进化方法来改进Photorhabdus菌株，然后与原线虫宿主重新结合。我们在LB液体培养基中培养了5个独立的Photorhabdus菌株，其中MBOA浓度为200 μg/mL，进行了50个12小时的传代周期(图2)。作为对照，将同一菌株在无MBOA的LB中培养50个12小时传代周期，或仅培养1个周期，然后保存于-80°C甘油中(图2a，b)。在定向进化过程的最后，我们用384孔微量滴定培养板评估了不同菌株的MBOA抗性。与祖先菌株相比，仅在LB中选择的菌株未观察到MBOA抗性的变化。但是，在MBOA选择的菌株中，MBOA抗性增加了40-183％(图2c-g)。通常， MBOA易感菌株的MBOA抗性增加幅度大于耐MBOA菌株。TT01的MBOA抗性增加最为显著，GI50从144增加到408 μg/mL(图2f)。在EN01和IL9中，GI50从大约140增加到250 μg/mL(图2c，d)。在CN4中，MBOA抗性从约240增加到330 μg/mL(图2g)。在HU2菌株中，GI50从240增加到280 μg/mL，尽管这种增加在统计学上并不显著(图2e)。不论培养条件如何，均可观察到MBOA选择菌株在含MBOA的培养基中健壮生长。这些实验表明，通过Photorhabdus的试验进化可以提高MBOA抗性。
多重突变与MBOA的抗性相关
Multiple mutations are associated with MBOA resistance
我们对不同的Photorhabdus菌株的全基因组进行了测序，以评估MBOA抗性是如何进化的。我们关注的是在LB选择菌株中不存在，而在MBOA选择菌株中存在的突变。我们筛选可能改变基因或蛋白编码功能的突变。使用这种方法，通过PCR和Sanger测序鉴定并确认了四个插入和两个非同义的点突变(表1，图3)。令人惊讶的是，菌株之间的已鉴定基因没有重叠，这表明Photorhabdus可通过多种机制获得MBOA抗性。MBOA选择EN01和IL9(M-EN01和M-IL9)在DNA定向RNA聚合酶rpo基因的不同亚基中分别具有单点突变(EN01：g.1636G> A，p.E546K；IL9：g.107G> T，p.G36V)(图3a，b)。此外，在M-IL9中，在ompR基因中检测到1,150 bp的插入(图4c)。该基因已被描述为孔蛋白的转录调控子。MBOA选择菌株HU2(M-HU2)在fabR中有一个885 bp的插入，fabR是一个编码不饱和脂肪酸生物合成调节因子的基因(图3d)。M-TT01在rfaL中有一个1,774 bp的插入，rfaL是一种参与外膜生物合成的连接酶(图3e)。最后，在M-CN4中，我们在水通道蛋白基因aqpZ中发现了1,774 bp的插入，这与膜的渗透性有关(图3f)。插入突变可使终止密码子移位，这极大地改变了蛋白质的二级和三级结构(图3a-f)。为了确认检测到的突变在MBOA抗性中的作用，我们使用了遗传方法。由于aqpZ基因的突变不会导致细菌生长或共生方面的特性，因此选择该基因用于进一步的功能鉴定。为了确定aqpZ基因在MBOA抗性中的作用，我们首先通过aqpZ野生型(WT)基因在阿拉伯糖诱导的质粒上反式表达来补充aqpZ突变株(M-CN4)，并在该新品系中检测MBOA抗性。用WT基因补充突变菌株可恢复MBOA的易感性(图4)。此外，我们测试了敲除aqpZ基因的大肠杆菌突变株(ΔaqpZ)对MBOA的抗性。正如所料，ΔaqpZ菌株比同类系WT菌株对MBOA的抗性更高。我们得出结论，aqpZ 失活会增加*Photorhabdus和*大肠杆菌对MBOA的抗性。
表1 进化的MBOA-抗性菌株中的突变
Mutations in evolved MBOA-resistant strains
图3 MBOA抗性增加与各种突变有关
Increased MBOA resistance is associated with various mutations
描述了在MBOA选择的菌株中发现的相对于祖先和LB选择菌株的非同义基因突变。
a，在M-EN01的rpoB基因中发生的非同义点突变。
b，在M-IL9的rpoA基因中发生的非同义点突变。
c-f，在M-IL9的ompR基因(c)，M-HU2的fabR基因(d)，M-TT01的rfaL基因(e)和M-CN4的AqpZ基因(f)中发生的插入突变。蓝色和橙色图式代表插入转座子的核苷酸位置。星号代表终止密码子。显示了祖先和MBOA选择菌株的蛋白质结构模型。
图 4 WT aqpZ基因的补充恢复了具有MBOA抗性的aqpZ突变株中MBOA的易感性
Complementation with WT aqpZ gene restores MBOA susceptibility in an MBOA-resistant aqpZ-mutant strain.
抑制细菌生长50%时的MBOA平均浓度。Ctr，对照，培养基中不添加阿拉伯糖；Ara，培养基中添加阿拉伯糖；None，未转变的细菌；EV，用空的阿拉伯糖诱导pCOLA-aratacI质粒转化细菌；aqpZ，用表达P.bodei CN4 WT aqpZ基因的阿拉伯糖诱导的pCOLA-aratacI质粒转化细菌；不同字母表示不同处理的菌株间在统计学上具有显著差异(采用Holm多重比较检验的双尾方差分析，P <0.05)。每个菌株测两次GI50，每次做2个生物学重复。
Photorhabdus 的MBOA抗性成本
Cost of MBOA resistance in Photorhabdus
高的MBOA抗性可能需要消耗某些成本，为了测试高MBOA抗性的潜在成本消耗，我们在没有MBOA的情况下测定了不同菌株的体外生长。5个菌株中的4个，MBOA的选择对其在LB中的生长没有负面影响。TT01是个例外，其MBOA抗性的大幅增加(高出183%)与生长的显著降低相关。此外，MBOA选择的HU2的生长滞后期较短，但其生长速率和总生长不受选择机制的影响。我们得出结论，在大多数测试菌株中，MBOA的选择对其生长几乎没有负面影响。(抗性增加不影响菌株生长)
MBOA抗性与共生关系的建立
MBOA resistance and the establishment of symbiosis
为了评估MBOA抗性的进化是否与Photorhabdus共生线虫生长或被感染幼虫恢复能力的变化有关，我们在含有不同细菌菌株的人工培养基中体外培养了无菌线虫卵和无菌感染线虫幼虫，并量化了幼虫线虫和成虫雌雄同体的发育数量。线虫的生长和雌雄同体的发育取决于细菌和线虫之间成功的相互作用(交互)，细菌产生生长因子刺激雌雄同体的发育。在所有受试菌株中，在含有祖先菌株和LB选择菌株的培养基中，我们观察到了所有幼虫阶段的线虫和能生育的雌雄同体(图5)。然而，当线虫在含有MBOA选择菌株EN01、IL9、HU2或TT01的培养基上生长时，仅观察到了少数幼虫线虫，未观察到任何雌雄同体(图5a -d，f-i)。相比之下，幼虫线虫和线虫雌雄同体在MBOA选择菌株CN4上成功发育(图5e，j)。因此，MBOA选择可能会削弱某些(而非全部)*Photorhabdus*菌株支持线虫发育的能力。
图5 对MBOA的选择改变了一部分细菌菌株的共生能力
Selection on MBOA alters symbiotic capability of a subset of bacterial strains.
a-j，从EN01、C-EN01或M-EN01半固态细菌培养物中孵育的EN01线虫卵(a，f)，从IL9、C-IL9或M-IL9半固态细菌培养物中孵育的IL9线虫卵(b，g)，从HU2、c -HU2或M-HU2半固体细菌培养物中孵育的HU2线虫卵(c，h)，从TT01、C-TT01或M-TT01半固体细菌培养物中孵育的TT01线虫卵(d，i)，从CN4、C-CN4或M-CN4半固态细菌培养物中孵育的CN4线虫卵(e，j)发育的早熟线虫(a-e)和雌雄同体雌虫(f-j)的平均数量。不同字母表示菌株间在统计学上具有显著差异(采用Holm多重比较检验的双尾方差分析，P <0.05)。用6个生物学重复进行一次线虫发育评估。
MBOA抗性和Photorhabdus对WCR的毒力
MBOA resistance and Photorhabdus virulence toward WCR
为了检测MBOA抗性菌株能否攻克WCR幼虫对苯并恶唑嗪酮类化合物的防御，我们将进化菌株直接注入WCR幼虫的血腔中。由于MBOA选择菌株HU2的MBOA抗性不强，MBOA选择会影响TT01的生长，因此本实验中我们只使用EN01、IL9和CN4及它们的变异菌株。用WT(野生型)或bx1突变型玉米的根饲喂WCR幼虫。Bx1基因编码一个色氨酸合酶α同系物，该同系物产生吲哚作为苯并恶唑嗪酮类化合物的前体，而玉米的bx1突变株中苯并恶唑嗪酮类化合物含量降低了95％，因此以bx1植株为食的WCR幼虫体内缺乏苯并恶唑嗪酮类化合物。当注射入WT喂养的、含苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫时，祖先菌株和LB选择的Photorhabdus菌株杀死了40~50％的幼虫。把祖先菌株和LB选择菌株注射入bx1喂养的、缺乏苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫，幼虫死亡率增加至80%【幼虫体内不含苯…时幼虫死亡率增加】，这证实了WCR隔离苯并恶唑嗪酮类化合物会降低*Photorhabdus*的感染性(图6a-c)。有趣的是，当注射MBOA选择菌株时，它们对含有和缺乏苯并恶唑嗪酮类化合物WCR幼虫的感染性一样高(图6a-c)。所有三个MBOA选择菌株比其祖先和LB选择菌株对含苯并恶唑嗪酮类化合物WCR幼虫的感染性明显更高(图6a-c)。综上，这些结果表明，MBOA的选择增加了MBOA抗性，并增强了*Photorhabdus *细菌对含苯并恶唑嗪酮类化合物WCR幼虫的感染力。(MBOA选择菌株的感染性与WCR中是否含苯…无关；且其感染性比原始菌株高)
图6 带有MBOA抗性共生体的线虫显示出对苯并恶嗪类配位WCR幼虫生物防治的改善作用
Nematodes harboring MBOA-resistant symbionts show improved biocontrol of benzoxazinoid-sequestering WCR larvae
a-c注射EN01、C-EN01或M-EN01 (a)，IL9、C-IL9或M-IL9 (b)和CN4、C-CN4或M-CN4 (c) 后死于败血症的WCR幼虫的平均百分比。WCR幼虫用含苯并恶唑嗪酮类化合物(WT)或无苯并恶唑嗪酮类化合物bx1突变株(BX-)的根饲喂。不同字母表示处理间的统计学差异显著(采用Holm多重比较检验的双尾方差分析，P <0.05)。评估了六个独立的重复样本，每个重复样本由4~5个幼虫组成(n =6)。实验进行2次。
d，在实验室条件下死于EPN攻击的WCR幼虫的平均百分比。不同字母表示处理间的统计学差异显著(采用Holm多重比较检验的双尾方差分析，P <0.05)。评估了5个独立的区域，每个区域由4~5个幼虫组成(n =15)。
e，在温室条件下死于EPN攻击的WCR幼虫的平均百分比。星号表示各处理间的的统计学差异显著(采用Holm多重比较检验的双尾方差分析，P<0.05）。评估了20个独立的重复样本，每个重复样本由4~7个幼虫组成(n = 20)。
f，统计分析结果。NS，无统计学意义。
进化的共生体线虫对WCR的侵染性
Infectivity of evolved symbiont–nematode pairs toward WCR
基于其较高的MBOA抗性、正常的生长和建立共生关系的能力，我们选择了CN4菌株进行进一步的实验。我们重新建立了共生关系，然后评估了携带CN4、C-CN4或M-CN4共生体的Heterorhabditis beicherriana CN4线虫对包含和缺乏苯并恶唑嗪酮类化合物WCR幼虫的感染力(图6d)。通过重新分离共生体、PCR和类水通道蛋白aqpZ基因的测序，证实了不同细菌共生体成功进行了再定殖。以不同密度梯度的线虫(每21cm3土壤中的线虫数从100到400个)侵染包含和缺乏苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫。总体而言，线虫对含苯并恶唑嗪酮类化合物WCR幼虫的杀灭量少于对不含苯并恶唑嗪酮类化合物WCR幼虫的杀灭量，而且在线虫释放量较多的地方，线虫对幼虫的杀灭量较多(图6d)。与携带的共生体无关，线虫杀死了等量的苯并恶唑嗪酮类化合物缺陷的幼虫，而这一数量也与线虫释放数量无关(图6d)。相比之下，携带祖先和LB选择细菌的线虫杀死的含苯并恶唑嗪酮类化合物WCR幼虫的数量比携带MBOA选择细菌共生体的线虫杀死的数量少3倍，而与每个区域释放的线虫数量无关(图6d)。在这些结果的基础上，我们还评估了新近再生细菌-线虫对对温室中主动取食的WCR幼虫的感染性(图6e)。携带MBOA选择共生体的线虫比携带其祖先共生体的线虫杀死更多的含苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫(图6e)。我们的结论是，通过设计一种共生细菌来抵抗植物毒素，可以提高EPNs感染并杀死隔离食草动物的功效。
讨论
食草昆虫在农业中造成严重的产量损失。WCR是最具破坏性的玉米害虫之一，未来破坏范围可能会进一步扩大。使用包括EPNs在内的生物防治剂是一种有前途的策略，可以在不使用合成农药的情况下对付诸如WCR之类的根食性害虫。要提高这种方法的经济可行性，首先要提高线虫生物防治的效果。本文我们报告了一项改进型EPNs策略，该策略依赖于工程线虫-细菌共生体来抵抗目标食草动物的化学防御。
我们的研究表明，提高Photorhabdus细菌抵抗苯并恶唑嗪酮类化合物的能力可以提高其EPN宿主对食草动物(这些草食动物通过积累这些次级代谢产物来保护自己)的感染性，从而验证了共生工程技术在改善生物技术或生物医学应用中的作用。人们已经做了大量工作来提高EPNs的功效，但是到目前为止它们的细菌共生体的特定性状还没有得到靶向改善。过去常用的一种方法是在线虫菌株之间交换共生体。不幸的是，使用这种非靶向方法并不总是能提高线虫的功效。我们的试验进化方法可能会构成未来选择程序的基础，以产生更好的线虫生物防治剂，或为生物控制设计其他有益的伙伴关系，如为战胜宿主而注射病毒的寄生蜂。
进化通常受到生理或生态平衡的限制。对有害物质的抗性与细菌的不同类型的成本相关，包括生长减慢、竞争能力受损和代谢失衡。我们发现MBOA抗性可能与巨大的成本相关。特别是，在五种测试菌株中有四种支持线虫发育的能力受到了损害，其中一种菌株的细菌生长显著降低。共生受损可能是由于Photorhabdus直接杀线虫活性、肠道定居减少和/或线虫生长因子产生减少所致。脂多糖生物合成缺陷的突变体通常表现出异常生长，这可以解释MBOA选择菌株TT01的细菌生长减少。独立于基本机制，在设计细菌共生体改进方案时，应考虑潜在的权衡。并不是所有被选择的菌株都对MBOA抗性有负面影响，这一事实说明，在鉴定改良共生体同时保持其他所需特性和功能时，使用不同起始材料和进行广泛筛选很有必要。
进化经常导致同一个问题有多个解决方案。我们发现MBOA抗性与不同品系不同位点的基因改变有关。检测到的基因组变化分为三大类：DNA转录、膜结构和膜通道。调节这些过程的基因突变通常与细菌的抗生素耐药性有关。例如，rpoB基因不同密码子的点突变使得不同细菌种类和菌株对利福平产生耐药性。同样，编码水通道和孔蛋白的基因中突变导致大肠杆菌对几种抗生素产生抗性。我们发现，每种菌株可能进化出不同的机制来克服MBOA毒性。我们发现，类水通道蛋白通道AqpZ的失活导致MBOA抗性，也许是通过限制这种毒素向细胞质中扩散所致。在不同的Photorhabdus菌株中发现的与MBOA抗性相关的位点，包括CN4中的aqpZ，代表了改善这种细菌共生体对环境毒素抗性的有希望的目标。
我们发现，选择一种细菌共生体来抵抗植物毒素，可以转化为其线虫寄主对抗(将毒素隔离起来进行自我保护)食草动物更好的感染潜力。这项工作强调了将期望的特性转化为细菌共生体以增强其宿主性能的潜力。
方法
细菌和线虫菌株
Bacterial and nematode strains
如前所述，Photorhabdus菌株分离自其线虫宿主中。简而言之，对100只感染线虫的幼虫进行表面消毒，用100 μL高压灭菌水重悬，然后用塑料杵碾碎。将所得溶液的系列稀释液涂在LB琼脂上。挑出类Photorhabdus菌落纯化，直到得到纯的培养物。通过获得的16S rRNA基因序列确认细菌的生物分类位置。线虫从德国(EN01)、澳大利亚(IL9)、匈牙利(HU2)或中国(CN4)收集，由e-nema提供或在特立尼达岛和多巴哥(TT01)收集，由D. Clarke(科克大学)提供。线虫收集的细节在其他地方有说明。所有线虫菌株均被鉴定为H. bacteriophora，CN4被鉴定为H. beicherriana。大肠杆菌K12 BW25113(WT)和大肠杆菌K12 JW0859-5(ΔaqpZ)从Keio收集中心获得。
MBOA抗性和细菌体外生长的评估
Evaluation of MBOA resistance and bacterial growth in vitro
为了评价MBOA对Photorhabdus生长的影响，通过测量384孔微量滴定板(Greiner Bio-One)中细菌培养物的光密度(OD600)来估计细菌的生长。细菌在28℃条件下培养20 h后稀释至OD600= 0.01-0.03。将十微升这些细菌溶液接种到浓度为0至650μg ml<sup)-1< sup="">的70μl含MBOA(Sigma-Aldrich)的LB(12.5 g l<sup)-1< sup="">; Carl Roth)中。将平板置于配备单色光学元件(Tecan Group)的Tecan Infinite M200多模式微孔读板仪中在27℃下孵育。每30 min测量一次OD600，持续48 h。每次测量之前，轻轻摇动板子(振幅为4.5 mm，摇晃周期为5 s)。原始数据通过生长曲线分析工具和微软Excel插件DMFit进行分析。为了评估14-ml培养管中MBOA的抗性，添加5 mL液体LB或含MBOA浓度为200 μg/mL 的LB，接种细菌，过夜培养至OD600为 0.5。细菌在28℃ 180 r.p.m下振荡培养24 h。用Tecan Infinite M200多模式微孔读板仪记录96孔板的OD600。
实验进化
Experimental evolution
将5株菌株(EN01、IL9、HU2、TT01和CN4)在含200 μg/mL MBOA(MBOA筛选，M-)或不含(对照，C-)的LB中于28℃ 180 r.p.m独立培养12 h(图2a)。这个浓度是根据观察到的GI50选择的。将1 mL所得细菌培养物转移至30 ml新鲜培养基中，再次培养。每12小时重复一次传代培养，共进行50次传代培养。此外，将来自第一个生长周期的无MBOA细菌培养物的等分试样用于制备甘油储备液，以保留原始基因型(进化祖先)。为了保证选择方案之前起始菌株的遗传同质性，将单个菌落获得的菌株作为实验进化的起始培养物。
全基因组测序和变异调用分析
Whole-genome sequencing and variant calling analysis
用GenElute细菌基因组DNA试剂盒(Sigma-Aldrich)提取基因组DNA。用TruSeq DNA PCR-Free LT Library Prep kit (FC-121-3003)制备基因组文库，以等摩尔浓度下汇集索引文库，并在Illumina HiSeq 3000仪器上测序(2,150 bp)。用Trimmomatic 0.36(options: SLIDINGWINDOW: 4: 8 MINLEN: 127)对原始Illumina读数进行质量修整。用SPAdes 3.10.1(k-mer大小为21、33、55、77、99和127 bp)组装所得读长，并用带有默认选项的SSPACE 3.0将获得的contigs组装到scaffolds上。用GapFiller 1.10填补缺口。删除短于200 bp的scaffolds和较长scaffolds(≥5,000 bp)中平均读取深度小于中位数读取深度20％的scaffolds。用Pilon 1.22对最终组件进行抛光。全基因组测序在伯尔尼大学的下一代测序平台上进行。MOBA选择菌株(M-)、对照菌株(C-)及其进化祖先之间的基因组差异被称作Pilon。用SnpEff鉴定了受变异影响的基因。用整合基因组查看器(Integrative Genome Viewer)对变异进行进一步分析。通过PCR和Sanger测序确认MBOA选择菌株中已鉴定的突变。Sanger序列可在https://doi.org/10.5061/dryad.mgqnk98w4上找到）。用SWISS-MODEL服务器进行蛋白结构同源建模。
反式互补菌株的产生和MBOA抗性的评估
Creation of in trans complementation strains and MBOA resistance evaluation
通过PCR扩增完整的WT aqpZ基因，并按照制造商的说明书，使用Gibson Assembly Master Mix(New England Biolabs)将其亚克隆到阿拉伯糖诱导表达载体pCOLA-ara-tacI77中。通过电穿孔将组装反应转化到大肠杆菌DH10B中。Sanger测序用于验证成功的大肠杆菌转化子(可在https://doi.org/10.5061/ dryad.mgqnk98w4上找到Sanger序列踪迹)。将携带完整WT aqpZ基因的质粒通过电转化的方式亚克隆到P. bodei M-CN4中，产生P. bodei M-CN4 aqpZ。将空载体用类似方法克隆到P.bodei M-CN4中以产生P.bodei M-CN4 EV。使用上述384孔板系统，在终浓度为0.1％的阿拉伯糖诱导剂存在或不存在下，在所得菌株中评估MBOA抗性。对照包括祖先菌株、LB选择和MBOA选择P. bodei CN4菌株。
大肠杆菌对MBOA的抗性
MBOA resistance in E. coli
为进一步研究aqpZ基因对MBOA抗性的重要性，我们比较了敲除了aqpZ的大肠杆菌突变株(ΔaqpZ)和其同基因WT菌株在不同MBOA浓度下的生长。如上所述，在384孔板中评估细菌生长。使用了以下菌株：大肠杆菌K12 BW25113(WT)和大肠杆菌K12 JW0859-5(ΔaqpZ)。
体外线虫培养和共生交换
In vitro nematode cultures and symbiont exchange
为了将不同的选择细菌转移到EPNs中，我们在半固体细菌培养中培养了经表面灭菌的线虫。为此，细菌在LB(25 g/L；Carl Roth)中过夜生长。然后离心所得的30 mL细菌培养物(OD600 = 1)，将沉淀重悬于K-培养基(3.1 g l 1 NaCl和2.4 gl 1 KCl)中。混合后，将培养物再次离心以除去所有剩余的K-培养基。将所得细菌沉淀与相似体积的半固相线虫生长Gelrite(NGG)培养基混合(1 L蒸馏水：0.5 g酪蛋白胨，1.5 g NaCl，0.75 g Gelrite，500 μL CaCl 2·2H2O(147 g/L)，500 μL MgSO4·7H2O(246.6 g/L)，12.5 mL KH2PO4(136 g/L)和500μl胆固醇(1 g/L, 在99%乙醇)。然后将1.5 mL含细菌的半固态NGG涂布在无菌培养皿(直径6厘米；Greiner Bio-One)中的5毫米固相NGG层(与半固态NGG相同，但包含1.5 g的Gelrite)的表面。在28℃培养48小时后，在半固体细菌培养中释放出200~250个表面灭菌线虫胚胎或150个表面灭菌线虫感染幼体。用1％次氯酸钠溶液(Sigma-Aldrich)对线虫进行表面灭菌5分钟，然后用无菌自来水清洗两次。收集线虫胚胎。孵育2-3周后收集线虫子代，并在Galleria melonella中繁殖幼虫。按上述方法，通过分离细菌，随后PCR扩增突变基因，确认成功的共生体交换。引物在补充表1中列出。
显微注射
Microinjections
将1 μL过夜细菌培养物(OD600 = 0.01)注入CO2麻醉的三龄WCR幼虫的头囊和第一腹壁段之间。对照组幼虫注射纯LB。细菌培养物用蓝色食用色素(Migros)着色，以确认注射成功。所有注射均使用微型注射器(Nanoject III，Drummond Scientific Company)与微型操纵器支撑基座(MärzhäuserWetzlar)耦合实现。插入的针头(3.5英寸玻璃毛细管，Drummond Scientific Company)由微量移液器拔出器(Sutter Instruments，型号p-97，Flaming / Brown)拉出，使用以下参数：加热温度521℃；拉90；速度90；时间250(125毫秒)；压力500。注射LB或未注射的幼虫作为对照。然后将幼虫放进装有2 g高压灭菌湿砂(Selmaterra，Bigler Samen AG)的Solo杯(30 ml，Frontier Scientific Services)中。实验场所在28℃孵育5 d。检查幼虫是否有Photorhabdus感染症状，如麻痹和发红。当幼虫颜色变化微妙时，将生物发光发射作为确定感染状况的一种替代方法。用TriStar LB 942多模式酶标仪(Berthold Technologies)记录生物发光。
线虫感染性测定
Nematode infectivity assay
为评估线虫的传染性，1 mL水中的100、200或400只感染幼虫被释放到含2 g无菌砂(Selmaterra，Bigler Samen)和5只二龄或三龄WCR幼虫的Solo杯(30 ml，Frontier Scientific Services)中。实验场所在28℃孵育5 d。然后，评估线虫的感染症状，并确定表现出线虫感染症状的幼虫死亡百分比。为了获得不含苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫，在bx1玉米植物的根中从卵孵化培育出昆虫。通过在B73植物的根部从卵孵化出昆虫，可以得到含苯并恶唑嗪酮类化合物的WCR幼虫。为了评估温室条件下的线虫感染性，将10只二龄WCR幼虫释放到根际中，并喂食5天。然后，每盆释放出2000或5000只侵染幼虫。6天后，收获植株，检查幼虫是否有线虫感染症状，以确定每盆线虫感染幼虫的百分比和昆虫死亡率。植株在120-mL塑料花盆（Semadeni）中生长，花盆内填满湿漉漉的洗过的沙子(1-4 mm；LANDI Schweiz)和一层2 cm厚的商业土壤(Selmaterra, Bigler Samen)。幼苗在温室条件下生长(23℃，相对湿度60％，16-h光照/ 8-h黑暗周期，以及由钠灯提供的250 mmol m-2s-1额外光照)。植物出苗后每隔2 天施MioPlant蔬菜和草药肥料（Migros）。实验使用的是13天龄的植物。
统计分析
Statistical analysis
所有数据集用Sigma Plot 12.0(Systat Software)进行方差(ANOVA)分析。分别用ShapiroWilk和Levene’s检验验证正态性和方差齐性。多组比较用Holm–Sidak post hoc tests。对不符合ANOVA假设的实验数据集分析前取自然对数、平方根或秩变换。
数据可用性
基因组序列已保存在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中。可以使用以下登录号检索它们：TT01-23：WSFH00000000，C-TT01：WSEZ00000000，M-TT01：WSFG00000000，IL9：WSFB00000000，C-IL9：WSEX00000000，M-IL9：WSFF00000000，M-CN4：WSFC00000000， EN01：WSFA00000000，C-EN01：WSEV00000000，M-EN01：WSFD00000000，CN4：WSEY00000000，C-CN4：WSEU00000000，HU2：NSCN00000000，C-HU2：WSEW00000000，M-HU2：WSFE00000000。Sanger序列跟踪可以在https://doi.org/10.5061/dryad.mgqnk98w4上找到。线虫菌株CN4、IL9、EN01和HU2是根据德国e-nema的材料转移协议获得的。TT01线虫可从不同的实验室获得，并由D. Clarke（科克大学）提供。根据合理的要求以及与作者和作为原料供应商的第三方的材料转让协议的成功完成，可以选择某些细菌和线虫。数据可在正文和补充材料中找到。所有原始数据集都存储在Dryad中：https://doi.org/10.5061/dryad.mgqnk98w4。
译者：文涛 南京农业大学
责编：马腾飞 南京农业大学
审核：刘永鑫 中科院遗传发育所
Reference
Ricardo A. R. Machado, Lisa Thönen,Carla C. M. Arce,Vanitha Theepan,Fausto Prada,Daniel Wüthrich,Christelle A. M. Robert,Evangelia Vogiatzaki,Yi-Ming Shi,Olivier P. Schaeren,Matheus Notter,Rémy Bruggmann,Siegfried Hapfelmeier,Helge B. Bode,Matthias Erb. Engineering bacterial symbionts of nematodes improves biocontrol potential of the western corn rootworm.Nat Biotechnol (2020) https://doi.org/10.1038/s41587-020-0419-1
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