植物发育和氮肥共同作用下的小麦根系微生物群落变化

Root-associated microbiomes of wheat under the combined effect of plant development and nitrogen fertilization

Microbiome

Impact Factor 10.465 | CiteScore 9.86

https://doi.org/10.1186/s40168-019-0750-2

发表日期：2019-10-22

第一作者：Shuaimin Chen（陈帅敏）^1，2

通讯作者：Chunsheng Hu(胡春胜)¹ and Binbin Li(刘彬彬)¹

合作作者：Tatoba R. Waghmode, Ruibo Sun, Eiko E. Kuramae

主要单位：

¹ 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心（Key Laboratory of Agricultural Water Resources, Hebei Key Laboratory of Soil Ecology, Center for Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 286 Huaizhong Road, Shijiazhuang 050021, China）

日报

本文通过研究四种不同水平的无机氮水平下小麦根和根际的细菌和真菌群落在分蘖期、拔节期和成熟期的组成、变化及根系释放有机碳(ROC)，根系分泌的有机酸以及根际的土壤有机碳(SOC)和土壤活性碳(SAC)，确定了氮输入的增加、碳有效性改变和植物根和根际微生物群落变化之间的关系。亮点如下：

1、小麦根区微生物群落结构变化受植株生长状况和氮素输入的共同驱动。

2、揭示了不同施肥水平下引起根际土壤活性炭(SAC)和土壤有机碳（SOC）变化规律的原因。

4、植物通过分泌有机酸来招募植物根际促生菌(PGPR)，从而对增加的N输入作出反应。

3、细菌群落组成与根释放的有机碳(ROC)密切相关，而真菌群落与根际土壤活性炭(SAC)密切相关。

摘要

背景

植物根在根内和根际组装微生物群落，且这些与根相关的微生物群落在植物营养和生产力中起着关键作用。众所周知，尽管在过去的50年里，中国农田增加了合成肥料的投入，这不仅导致了产量的增加，还导致了环境问题。我们缺乏这样一个全面的理解，即在提高营养投入的情况下，作物是如何招募与根相关的微生物群落的，尤其是通过调整根际代谢物和分泌物的数量和组成。

方法

我们对长期施用四种不同水平的无机氮的情况下小麦(Triticum aestivum L.)根和根际的细菌和真菌群落在分蘖期、拔节期和成熟期的组成进行了研究。我们对根系释放有机碳(ROC)，根系分泌的有机酸以及根际的土壤有机碳(SOC)和土壤活性碳(SAC)进行了定量研究。

结果

对根系释放有机碳(ROC)水平在小麦不同生长阶段之间存在显著差异，与细菌群落的相关性大于与真菌群落的相关性。长期施氮提高了根际土壤有机碳(SOC)和土壤活性碳(SAC)水平，但在各生育期间差异不大。在植物的生长阶段根际微生物群落结构随施氮量的增加呈下降趋势。此外，在根样品中，与分蘖期相比，拔节期和成熟期的细菌和真菌属明显增多。许多细菌属因施N肥而发生改变，包括节杆菌，芽孢杆菌和德沃斯氏菌属，其与乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸的含量水平显著相关。

结论

结果表明，小麦根区微生物群落结构变化受植株生长状况和氮素输入的共同驱动。植物生长期对细菌的影响大于真菌的影响。许多细菌属被描述为正相关于氮肥的植物根际促生菌(PGPR)，并且它们的丰度显著相关于有机酸水平，表明有机酸的分泌可能是植物在根区招募有益微生物以应对高氮输入的策略。这些结果为深入研究氮输入增加、碳有效性改变和集约化农业生态系统植物根和根际微生物群落变化之间的关系提供了新颖的见解

关键字：根相关微生物，根系分泌物，有机酸，氮肥，植物生长阶段

背景

植物微生物组为宿主植物提供了额外的基因库，因此常被称为第二植物基因组或扩展基因组。值得注意的是，近年来，植物根相关微生物群落因其在宿主营养、发育和免疫方面的重要作用而受到了前所未有的关注。最近的一项研究表明，植物的根从周围土壤聚集微生物群落。这些区域中的微生物群可能对宿主植物有益，也可能有害，这种平衡的改变可能会极大地影响农业生态系统中的作物生产。因此，了解根相关微生物群落对土壤管理措施和植物生理状态的响应具有重要的农学意义。

中国是世界范围内最大的化学氮肥消费国，将全球30%以上的肥料用于大约全球9%的农田(FAOSTAT, www.fao.org)。化肥的高损失率和低利用效率是我国农业生产中普遍存在的问题。例如，在华北平原(North China Plain，NCP)（中国最大的农作物产区之一），一个小麦生长季节每公顷土地使用近300公斤氮肥，据估计超过30%的氮肥被过度使用。过量施用氮肥导致了地下水硝酸盐污染、温室气体排放增加、和土壤酸化等一系列环境问题。特别是，2005年氮肥导致的N₂O排放量比1980年增加了460 Gg N yr ^-1。可被植物吸收的氮主要依赖于根相关的微生物群落。然而，在氮素应用和华北平原（NCP）一样高的地区，根区微生物群落是如何响应氮素有效性的变化以及由此引起的植物根系分泌物的变化的，目前还没有研究。

根分泌物和根际土壤的碳水平是影响植物氮素吸收和微生物群落的重要因素。例如，丛枝菌根真菌最近被证明能够将氮转移到植物中，这种真菌共生体介导的氮吸收是由宿主植物提供的碳刺激的。植物根系释放的不稳定有机碳可以促进或抑制土壤有机质的矿化，这是根际中植物-土壤相互作用的一个重要方面，被称为根际启动效应。越来越多的证据表明，根际启动是植物获取有机氮资源的重要策略，且在森林生态系统中，CO₂升高引起的启动效应是由根沉积物的增加和微生物活性增强暂时驱动的。考虑到根区碳库对农业生态系统中作物氮回收率的重要性，需要对氮肥引起的不同碳利用水平下的根相关微生物群落进行调查。

根相关的微生物群落受周围土壤条件和宿主植物的动态影响。土壤被认为是“微生物种子库”，为植物提供了大量的微生物候选库。作为调节本地生长条件的一种策略，植物有能力通过向根际分泌生物活性分子来改变土壤微生物群落的土壤条件，从而改变土壤环境。因此，不同的植物物种或基因型可以通过根系形态和根系分泌物类型的差异来招募特定的微生物组。此外，根系分泌物的组成和根相关的微生物群落结构受到植物生长期的强烈影响。在植物发育过程中，根相关微生物群落组成的变化已经在最近的许多研究中通过分子技术手段得到了阐明，这些变化被认为是由根系分泌物的变化引起的，虽然在这些研究中没有对根系分泌物的成分和数量进行评估。

根系分泌物是由广泛的含碳代谢产物组成，如糖类、氨基酸和有机酸,是宿主植物的重要碳成本，也是微生物的底物和信号分子, 导致宿主植物与微生物之间复杂的生物地球化学交换。作为根系分泌物的主要低分子量化合物，有机酸已被证明是形成根际微生物群落结构的选择剂，其刺激特定微生物种群的生长和/或抑制其他微生物种群的发展。培养实验表明，与碳水化合物相比，有机酸对土壤微生物群落优势类群的丰富度和结构影响更大。有机酸的分泌是植物应对磷、氮等营养物质缺乏的重要策略。然而，由于农业系统中化肥的过度使用而导致的营养物质浓度升高对有机酸分泌的影响及其对微生物群落的影响尚未得到研究。

在本研究中，我们采集了4个氮肥水平下小麦植株3个生长阶段的根和根际样本。通过测定根系分泌物的数量与组成及根际中的有机碳，评估植物的生长发育和长期施氮肥对碳有效性的影响。我们采用16S和18S rRNA基因扩增子测序技术对根际和根中的细菌和真菌群落进行检测。本研究的结果提供了关于根系分泌物、根际碳和根相关微生物群落在不同植物生长阶段和氮肥水平上的深层次的信息。

结果

根系分泌物及根际中的碳

Carbon in the rhizosphere and root exudates

土壤活性碳(Soil active carbon, SAC)是构成土壤食物网燃料的土壤碳的一部分，它对养分循环有强烈的影响。N0对照(不施氮肥)的小麦根际土壤活性炭显著低于N100、N200和N300施肥处理(分别为每个小麦生长期施氮量为100、200和300公斤)的小麦，虽然在大多数肥料处理样品中没有观察到显著的差异（图1a)。根际土壤有机碳水平也表现出相似的变化规律（图1b）。新鲜根系单位重量释放有机碳(root-release organic carbon, ROC)测定结果如图1c所示。小麦分蘖期和拔节期，4个施肥水平的根系释放的有机碳（ROC）差异不显著。在小麦成熟阶段，N200和N300样品的根系释放的有机碳均显著高于N0和N100的样品。在小麦的不同生长阶段，拔节期(2.23-2.43 mg/g根)的根系释放的有机碳值高于分蘖期(0.30-0.34 mg/g根)和成熟期(1.08-1.77 mg/g根)。值得注意的是，报道的浓度被归一化为根重，总根系释放的有机碳值随着施氮量的增加而增加。

图1.小麦3个生长期4个不同氮肥水平的土壤活性碳(a)、土壤有机碳(b)、根系释放有机碳(c)和有机酸(d)。误差线表示三个重复的标准偏差。不同字母表示各生育期氮肥水平差异有统计学意义(P < 0.05)。

本研究测定了8种有机酸(乙酸、草酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸); 除丙酮酸和延胡索酸外，其余均在根样品中检出。有机酸的含量和组成随生育期的不同而不同(图1d)。分蘖期有机酸浓度总和为0.06-0.10 mg C/g根，以琥珀酸、柠檬酸和苹果酸为主；它们分别占测定有机酸的46-62%、17-26%和14-20%。拔节期总有机酸浓度为0.39-0.76 mg C/g根;以琥珀酸为主，占有机酸总量的82-87%。成熟期有机酸浓度之和为0.14-0.23 mg C/g根，其中柠檬酸和苹果酸占主导地位，分别占有机酸总量的55-92%和7-17%。

细菌群落对植物发育和氮肥的响应

Bacterial community responses to plant development and N fertilization

对小麦三个生长阶段和四个氮肥水平的根际和根样品进行了高通量测序。小麦不同生长阶段和施氮量下根际和根样品的细菌群落组成如图2所示。根际样品中，分蘖期4个施肥水平的细菌群落组成差异显著(图2a)。拟杆菌门的相对丰度降低，放线菌门和变形菌门(α-变形菌门和γ-变形菌门)的相对丰度随施氮量的增加而增加。拔节期和成熟期4个N处理样品间细菌群落组成比分蘖期相似。在根样品中，变形杆菌门、放线菌门和拟杆菌门是三个优势门(图2b)。放线菌门的相对丰度随施氮量的增加而降低，而厚壁菌门在拔节期明显高于其他两个阶段。

图2.根际(a)和根(b)样品中门水平的细菌群落组成。根际(c)和根(e)样品的细菌群落主坐标分析(PCoA) 。差异距离显示了根际(d)和根(f)样品在不同生长阶段的微生物群落结构的差异。PCoA和差异距离是基于OTU水平上的Bray-Curtis距离。

主坐标分析(PCoA)在操作分类单元(OTU)水平进行。根际(图2c)和根样品(图2e)的OTUs均被植物生长阶段明显的分离开，而根际氮肥效应只在分蘖期出现。在各氮肥水平下计算三个生育期间的差异距离，且根际中不同生长阶段微生物群落结构的差异随着根际施氮量的增加呈下降趋势(图2d)。基于OTU水平上微生物群落结构的冗余分析(RDA)表明，ROC与细菌群落显著相关，分别占根际和根样本变异的19.0%和12.7%(表1)。Mantel检验结果也显示ROC与细菌群落具有显著的相关性(表2)。

表1. 根据冗余分析(RDA)，不同碳库解释的细菌和真菌群落差异

显著性水平:P< 0.05, ;P < 0.01,^** ;P < 0.001,^**。ROC:根释放有机碳;SAC:土壤活性炭;SOC: 土壤有机碳。
分析基于OTU水平进行

表2. 细菌和真菌群落与根际和根中有机酸和碳库的相关性

Mantel检验采用Pearson相关法。碳库是根据欧氏距离计算的，根据Bray-Curtis距离计算微生物群落结构(OTU水平)。P是显著性水平。显示P<0.05的值。ROC:根释放有机碳;SAC:土壤活性炭;SOC: 土壤有机碳

绘制了细菌群落在三个生长阶段和四个氮肥水平下的在目(图3a,b, Additional file 2)和属(Additional file 1: Figures
S2 and S3, Additional file 3) 两个分类水平上的说明微生物群落组成差异的热图。在目水平上，根际样品中微球菌、丙酸杆菌、盖菌、杆菌和根瘤菌的相对丰度(成对t检验)在拔节和成熟阶段显著高于分蘖期(图3a)。在根样中，拔节期的杆菌、乳酸杆菌和伯克氏杆菌的相对丰度明显大于其他两个时期。分蘖期根瘤菌和鞘瘤菌的相对丰度与氮肥水平呈正相关，而在所有生长阶段的根样本中，链霉菌则呈现出相反的趋势(图3b)。在属水平上(Additional file 1: Figure
S2)，在拔节和成熟阶段根际样品中的节杆菌、单孢原菌、新心菌、链霉菌、芽孢杆菌的相对丰度显著高于分蘖期。在根样例中(Additional
file 1: Figure S3),微杆菌、节杆菌、鞘单胞菌、灵芝菌的相对丰度与氮肥水平呈正相关，而链霉菌在各生育阶段与施氮量呈负相关。此外，芽孢杆菌、海洋杆菌和乳球菌的相对丰度在拔节期明显高于其他生长期。

图3. 优势菌的目水平热图(左)和根际(a)和根(b)样品中优势菌目与有机酸(右)的Pearson相关分析。属水平的结果在(Additional file 1: Figures S4 and S5)中列出。

NA表示无显著相关性(P > 0.05)

曼特尔检验表明，这6种有机酸与根细菌群落具有显著的相关性(表2)。为了深入了解细菌群落对有机酸的反应，对这6种有机酸与细菌目(图3a, b)和属(Additional file 1: Figures S2 and S3)的相关性进行了进一步分析。乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸与根际样品中的微球菌目、芽单胞菌目、偶氮螺旋菌目和伯克霍尔德氏菌目及根样品中的鞘脂杆菌目、芽孢杆菌目和乳酸菌目呈正相关而与根际样品中的几丁噬菌体、细胞噬菌体、糖胞菌目和假单胞菌目及根样品中的细胞原噬菌体，纤维细菌，糖精菌和粘液球菌呈负相关(图3a, b)。在属水平上，乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸与根际样品中的节杆菌属、德沃斯氏菌属、马赛菌属及根样品中的节杆菌属、微单孢菌属、诺莫菌属、地杆菌属、芽孢杆菌属、海洋杆菌属、乳球菌属、马赛菌属和寡养单胞菌属呈正相关而与根际样品中的鞘氨醇杆菌属、乡村农研丝杆菌、Taibaiella、Ohtaekwangia、Mucilaginibacter和Acidibacter及根样品中的乡村农研丝杆菌和Ohtaekwangia呈负相关 (Additional file 1: Figures S2 and S3)。

真菌群落对植物生长发育与施N肥的响应

Fungal community responses to plant development and N fertilization

根际和根样品中真菌门水平的群落组成分别如图4a和b所示。在根际和根样品中，子囊菌是优势门(> 75%)。在根际样品中，壶菌在拔节期的相对丰度高于分蘖期，而接合菌在拔节期和成熟期的相对丰度高于分蘖期(图4a)。根际样品中占主导地位的真菌目(相对丰度>1%)为卷须目(5-17%)、多孢目(5-31%)和腔菌目(13-30%)而根样中占主导地位的真菌目(相对丰度>1%)为煤炱目(6-23%)、多孢目(5-30%)和腔菌目(20-62%)(Additional file 1: Figure S4,Additional file 4)。所鉴定的真菌目对氮肥或植株发育阶段没有明显的响应模式，除了Calosphaeriales、Hypocreales和Sordariales，它们与根际氮肥水平一般呈正相关;根样品中多孢子菌的相对丰度随植物的生长而增加。群落属水平的组成表明，镰刀菌属为优势属(Additional file 1: Figure S5, Additional file 5),分别占根际和根样品相对丰度的9-23%和16-47%。与细菌群落的PCoA相比，基于OTUs相对丰度的真菌群落的PCoA在根际和根样品的生长阶段中没有显示出明显的分离(图4c and e)。尽管如此，与对细菌群落的观察结果一致，在根际样品中，随着施氮量的增加，不同生长阶段的距离差异有减小的趋势(图4d)。RDA显示，土壤活性炭SAC和土壤有机碳SOC分别占根际真菌群落变异的12.6和14.8%，显著高于根释放有机碳ROC解释的比例(表1)，表明真菌群落受根际碳的强烈影响。曼特尔试验表明，在根样品中，土壤活性炭SAC和真菌群落之间存在显著的相关性 (Table 2)。

图4.根际(a)和根(b)样品中的真菌群落组成。根际(c)与根(e)样品中真菌群落的PCoA分析。根际(d)和根(f)样品的相异距离。OTU水平上基于Bray-Curtis距离的PcoA和相异距离。

细菌和真菌的关系

Correlations between bacteria and fungi

我们对根际和根样品中的细菌和真菌在三个生长阶段的相关性进行评估。对相对丰度大于1%的属进行分析，根际样本中有39个细菌属和24个真菌属，根样本中有45个细菌属和24个真菌属。在细菌和真菌的根际样本中(表3和图5a)，分蘖期、拔节期和成熟期分别有123、82和100个显著相关(p < 0.05)。分蘖期的细胞弧菌、念珠菌和假黄单胞菌，成熟期的念珠菌和节杆菌与9个以上的真菌属显著相关。在根样本中的细菌和真菌中，分蘖期有106个显著相关，拔节期有增加到128个，成熟期增加到130个(表3)。在拔节期，假丝酵母菌、节杆菌和黄体杆菌与9个以上真菌属显著相关(图5b)。

表3. 根际和根样品中细菌和真菌属的相关性

图5. 根际(a)和根(b)样品中优势细菌与真菌属(相对丰度>1%)在分蘖、拔节和成熟三个生长阶段的相关性。采用Spearman法对所有两两比较进行统计学意义分析; 只有显著相关，正相关(蓝色方块)或负相关(红色方块)(p值< 0.05)被显示。

讨论 Discussion

氮肥的施用是最重要的农业措施之一，在过去的半个世纪里，氮肥的施用促进了全球农作物产量的增长。以往的研究表明，超过一定阈值的过量氮肥并不会进一步提高作物产量，反而会导致大量的N损失并造成了一系列的环境问题。氮肥的过度使用是当前我国农业生产面临的主要问题之一，特别是在集约化农业地区，如华北平原，提高氮素利用效率和降低氮肥水平仍然具有挑战性。由于细菌和真菌在根区氮素周转中的重要作用，有必要对根相关菌群对氮肥的响应进行综合研究，特别是与根系分泌有关的相关菌群，这已被证明对植物吸收氮至关重要。

在本研究中，不同氮肥处理(N100、N200和N300)下根际土壤活性炭(SAC)和土壤有机碳(SOC)的数量较对照(N0)显著增加。这些变化可以初步归因于氮肥的长期效应，其增加了根系生物量和根系分泌物总量。此外，由于作物残体被还田，氮肥处理增加了地上作物的生物量，从长期来看也促进了土壤活性炭(SAC)和土壤有机碳（SOC）水平的提高。根际土壤活性炭(SAC)和土壤有机碳（SOC）不像根释放的有机碳(ROC)那样随植物生长阶段而波动（图1），说明不同施肥水平下根际土壤活性炭(SAC)和土壤有机碳（SOC）的差异主要是由于作物根系分泌物的累积变化和在20年的栽培过程中作物残体的还田引起的。

根际细菌群落结构在分蘖期因施氮量的不同而明显分离，但在拔节期和成熟期则聚集在一起（图2c）。因为在拔节和成熟阶段根释放的有机碳(ROC)水平明显高于分蘖期，并且冗余分析(RDA)和Mantel试验表明，细菌群落与根释放的有机碳(ROC)密切相关，不同氮肥水平下微生物群落相似性的增加可能是由于根系分泌物的影响超过了根际氮有效性的影响。

植物根际促生菌(PGPR)与植物的根有着密切的联系，能够增强宿主植物对环境的适应能力。本研究中，根际节杆菌、芽孢杆菌、麻丝菌和假丝酵母的相对丰度和根芽孢杆菌、海洋杆菌、乳球菌和麻丝菌的相对丰度在拔节和成熟期高于分蘖期（图3a），这些属被认为是重要的植物根际促生菌(PGPR)。此外,皮尔逊相关分析表明，这些类群与一种或几种有机酸呈正相关（图3b）。有趣的是，节杆菌、芽孢杆菌和奉献菌也与N输入水平呈正相关。对这些结果的一个可能的解释是，植物通过分泌有机酸来招募植物根际促生菌(PGPR)，从而对增加的N输入作出反应。事实上，根分泌有机酸招募植物根际促生菌(PGPR)已经在之前的一些研究中得到了证明。

有机酸的组成和量也随着施肥水平的变化而变化。一个直接的解释是增加氮素改变了植物的生理状态。对这一现象的另一种可能的解释是，过量的N输入导致了土壤中其他营养物质的消耗，如磷。调节根系分泌物的数量和组成是植物为应对有限的养分而发展起来的一种策略。为了支持这一观点，有机酸的分泌被认为是一种从土壤无机复合物中释放磷酸盐的有效途径。

根际真菌群落受植物生长阶段、土壤特征和植物种类的影响。最近的一项研究还表明，凋落物的施用引起的启动效应可能通过促进真菌生长而增强根际活性。但在本研究中，生长阶段对真菌群落结构没有显著影响（图4）。此外，RDA表明，土壤活性炭(SAC)对根际和根样品的真菌群落结构都有实质性的影响（表1）。最近的一项研究表明，植物内生真菌是从周围土壤中招募的真菌的一个子集，因此，根系真菌和根际真菌与周围土壤的土壤因子密切相关也就不足为奇了。

结论 Conclusions

植物生长发育和长期施氮对根相关微生物群落结构都有重要影响。在根区，细菌群落组成与根释放的有机碳(ROC)密切相关，而真菌群落与根际土壤活性炭(SAC)密切相关。植物生长发育阶段对根际和根际样品中细菌和真菌群落的相关性有不同程度的影响。有机酸和氮肥水平与许多植物根际促生菌(PGPR)相关，表明有机酸的分泌可能是植物招募有益微生物的一种重要策略。这项研究代表朝着更机械化地理解微生物群落组成的变化如何调节和反映集约化农业生态系统中氮输入的影响迈出了一步。

方法

田间试验和样品采集

Field experiment and sample collection

1998年，在中国河北省栾城县栾城农业生态系统试验站(37°53′N, 114°41′E，海拔50米)进行了长期氮肥田间试验。试验包括4个施肥水平，分别为每个小麦生长期0、100、200和300公斤N/公顷，施于3个重复的地块。本研究使用的土壤为潮土，pH为7.53-7.95，总碳(TC)为17.03-20.80 g/kg，总氮(TN)为1.13-1.70 g/kg。分别于2016年11月(Feekes生长期2-3期)、2017年3月(Feekes阶段6-7期)、2017年5月(Feekes阶段11)三个小麦生长期采集根际和根样品，在本研究中分别称为分蘖期、拔节期和成熟期。在不同氮肥水平下，每个生长期采集3个重复的根芯样本。本研究中的根际样品严格定义为根表面2毫米以内的土壤。轻轻地摇动根部以去除松散的土壤团块，然后通过刷去根部残留的土壤来仔细收集根际样本。为了减少对附着在根上的丛枝菌根真菌和下游DNA提取的影响，用无菌蒸馏水冲洗根，用于根分泌物和根微生物群落的分析。我们将本研究中的“根微生物群落”定义包括根内层和根表面的微生物群落，因为样本采集方法没有区分这两个取样部分。

SAC、SOC、ROC和有机酸的测定

Determination of SAC, SOC, ROC and organic acids

由于只调查了根际和根样品，土壤有机碳和土壤活性炭在本研究中指的是根际的土壤有机碳(SOC)和土壤活性炭(SAC)。土壤有机碳(SOC)是以传统的方法定义，指土壤中有机化合物的碳成分。本研究将根系释放有机碳(root-release organic carbon, ROC)定义为根系分泌物中的总碳(标准化的每克根系)。采用高锰酸钾(KMnO₄)氧化C法测定土壤活性炭(SAC)。简而言之，将1.0 g风干土壤与20 ml浓度为0.02 M的KMnO₄混合，在25℃下以200 rpm的速度摇动2分钟。然后，950×g离心5 min，用去离子水按1:50比例稀释上清。用紫外分光光度计在550 nm处测定了稀释后的样品的吸光度(UV-2450,
Shimadzu)。选择标准的范围是为了充分覆盖样品的浓度。利用KMnO₄浓度的变化来估计氧化碳的量，假设在氧化0.75 mM或9 mg碳的过程中消耗了1 mM MnO₄⁻(Mn (VII)到Mn (II))。SOC采用K₂Cr₂O₇-H₂SO₄氧化法测定。

取新鲜根0.4 g，加入1.5 ml消毒去离子水，以1400转/分钟的速度振荡30分钟，提取根渗出液。样品以13000×g离心5 min，并且上层清液通过0.22 μm注射器式过滤器进行过滤。然后，用总有机碳分析仪测定0.5 ml过滤过的上清液的ROC。用配备反相硅胶C18柱(Atlantis T3,
250 × 4.6 mm, 5 μm, Waters)的高效液相色谱仪测定有机酸(Waters e2695, Milford, MA, USA) ；10 μl根分泌物样本在用20 mm磷酸钠缓冲液(pH=2.73)以流速为0.5 ml/min，温度为30℃的条件下被提取。在210 nm处监测吸光度，并且用标准有机酸建立了标定曲线。

DNA提取和扩增子测序

DNA extraction and amplicon sequencing

总基因组DNA通过使用E.Z.N.A.®土壤DNA试剂盒(Omega Biotek, Inc., Norcross,
GA)按照说明书从0.5 g的根际土壤或用液氮研磨得到的0.4 g的新鲜根粉中提取。分别用引物对341F:785R和FR1:FF390扩增16S和18S rRNA基因。引物中含有简并的碱基，用于在第二轮PCR中连接Illumina测序接头和双端索引条形码。PCR反应体系为25μl，其包含12.5 μl预混料(Phanta高保真度DNA聚合酶,Vazyme生物科技有限公司,中国),1 μl引物(10μM),和 1μl DNA模板(大约20 ng的DNA)。PCR条件为:95℃，3 min;95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s 25个循环;最后在72°C下延长10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用AMPure XP beads(Beckman Coulter, Inc.,Brea, CA) 按照说明书进行纯化。随后进行8个循环的PCR，将双索引条形码和Illumina测序接头添加到每个样本中，然后用AMPure磁珠对PCR产物进行纯化。将每个样品等量的PCR产物进行混合通过Illumina MiSeq PE300平台(GENEWIZ, Suzhou,China)进行测序。测序数据存放在欧洲核苷酸档案库，接入号为PRJEB33393。

测序数据分析

Analysis of sequencing data

利用微生物生态学的定量研究(QIIME)程序分析序列。接头序列、条形码和以及每个读长末端的30个低质量碱基被移除，之后使用fastq-join方法以最小重叠区为20bp，重叠区10%的最大错配率进行正向和反向读长拼接。丢弃低质量序列(Phred质量评分Q < 20或长度小于200 bp)，且在USEARCH程序中使用UCHIME算法过滤掉嵌合体。使用UCLUST方法将高质量的数据按97%的相似度聚成可操作分类单元(OTUs)。SILVA 16S和18S rRNA数据库分别作为细菌和真菌参考数据库。在去除非细菌和非真菌的OTUs和singletons后，对高质量序列进行分析。

质控后，每个样本分别从根际和根样本中获得9003-33,523和5811-27,012个细菌序列。根际和根样本的细菌OTU表分别亚采样到8500和5500个序列。根际样本亚采样的序列被聚成1002-3256个OTUs(平均2588个)和根样本亚采样的序列被聚成817-2031个OTUs(平均1573个)。对于18S rRNA基因序列，质控后，每个样本分别从根际和根样本中产生4777-29,260和1492-5413条高质量序列。根际和根样品的真菌库分别被亚采样到为4000和1000个序列。根际样本亚采样的序列被聚成704–1084个OTUs(平均895个)和根样本亚采样的序列被聚成192–301个OTUs(平均263个)。基于合并序列的相似性(ANOSIM)初步分析显示，细菌和真菌群落的根际和根样本之间存在显著差异(P < 0.001); 因此，对根际和根样品分别进行了序列分析。

统计分析

Statistical analyses

统计分析采用SPSS20.0 (IBM，芝加哥，美国)和R进行。利用SPSS 20.0软件采用方差分析和最小显著性差异分析(LSD)，检验施氮水平对土壤有机碳(SOC)、土壤活性炭(SAC)和根系分泌物的影响是否显著。使用R中的vegan包进行冗余分析和Mantel检验来确定碳库和OTU水平的微生物群落之间的相关性。使用R中的psych包对有机酸与细菌类群、细菌类群与真菌类群进行Pearson相关分析。采用Bray-Curtis相异性距离矩阵进行相似性（ANOSIM）分析以确定根际和根样品之间的细菌和真菌群落的显著差异。

Received: 2 December 2018 Accepted: 13 September 2019

Published online:22 October 2019

编译：马腾飞 南京农业大学

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

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