霉酚酸和IMD-0354对SARS-CoV-2的抗病毒活性

本文为读后感，原文见文后，读后感作者张楚

摘要：本研究分析了霉酚酸(MPA)和IMD-0354的抗SARS-CoV-2活性，并根据其抗其他冠状病毒的活性进行了筛选。由于它们还能抑制登革病毒(DENV)感染，因此也对其他抗DENV化合物/药物进行了评估。利用SARS-CoV-2感染的VeroE6/TMPRSS2细胞，MPA和IMD-0354显示出显著的抗SARS-CoV-2活性，而其他抗DENV化合物/药物则未显示出明显的抗SARS-CoV-2活性。虽然MPA仅使病毒RNA水平降低约100倍，但其EC50低至0.87μM，这在霉酚酸酯治疗剂量下很容易实现。MPA以冠状病毒类木瓜蛋白酶为靶标，其研究将有助于抗SARS-CoV-2新药的开发。

新冠肺炎疫情于2019年12月在中国武汉爆发，迅速蔓延至全球。3月11日，世界卫生组织宣布新冠肺炎为大流行，以强调全球应对这种疾病的迫切必要性。由于没有药物和疫苗，因此迫切需要开发。在本研究中，作者检测了霉酚酸(MPA)和IMD-0354对SARS-CoV-2的抗病毒活性。以往的研究表明，MPA对MERS冠状病毒、人冠状病毒OC43、HCoV-NL63和小鼠肝炎病毒(MHV)有抗病毒活性IMD-0354对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)有抗病毒活性。作者之前已经证明MPA和IMD-0354对登革病毒(DENV)也显示出抗病毒活性。

本研究采用简单的细胞病变效应观察法(CPE法)作为病毒生长的指标，粗略评价单个化合物/药物对SARS-CoV-2感染的抗病毒活性。该方法是基于最近发现的VeroE6/TMPRSS2细胞对SARS-CoV-2感染具有高度的敏感性和强烈的CPE而建立的。将SARS-CoV-2和不同浓度的单个化合物/药物混合并加入到VeroE6/TMPRSS2上。由于强烈的CPE，感染的细胞从培养板上脱落，几乎检测不到结晶紫染色。如果化合物/药物显示抗病毒活性，单层仍然附着，结晶紫染色仍然清晰可见。结果表明，用适当浓度的IMD-0354或7种抗DENV的化合物(CCT08159、PD102807、CD437、维甲酸、吲哚青碱、马普替林和喹啉)处理细胞后，细胞仍保持清晰可检测的结晶紫染色。然而，在高浓度化合物/药物处理的细胞中观察到较差的结晶紫染色，可能是由于细胞毒性。(Fig.1)蓝条表示病毒CPE被阻断的最低药物浓度水平，以及结晶紫染色后细胞保持附着的最低药物浓度水平(抗病毒水平)。红条表示药物的最低浓度水平，在该浓度水平下，药物表现为细胞毒性，结晶紫染色较差(细胞毒性水平)。这些结果表明，CCT08159、CD437、吲哚青碱、马普替林和喹卡林的有效浓度范围(蓝条和红条之间；图1)较窄，显示出低细胞毒性的抗病毒活性。因此，这五种化合物/药物的抗SARS-CoV-2活性仍不确定。MPA在CPE实验中未显示抗SARS-CoV-2活性。另一方面，IMD-0354和另外两个化合物(PD102807和维甲酸)具有明显的抗SARS-CoV-2活性，但PD102807和维甲酸完全抑制CPE所需的药物浓度较高(32μM)。因此，CPE试验表明IMD-0354可能是抗sars-cov-2药物的候选药物。

图1： CPE试验。将SARS-CoV-2Wk521株(12株)与V-eroE6/TMPRSS2细胞单层细胞在含不同浓度药物的培养基中培养50h(MOI=0.01)。50h孵育后，细胞单层结晶紫染色。蓝条表示病毒CPE被阻断的最低药物浓度水平，以及结晶紫染色后细胞保持附着的最低药物浓度水平(抗病毒水平)。红条表示药物的最低浓度水平，在该浓度水平下，药物表现为细胞毒性，结晶紫染色较差(细胞毒性水平)。

接下来，为了定量评价这些化合物/药物的抗SARS-CoV-2作用并计算其EC50，采用与上述CPE方法相同的实验条件，分析细胞内SARS-CoV-2RNA的水平。在CPE试验中，每个图表(图2)中红色条上方的化合物/药物浓度表示细胞毒性。在CPE试验中，每张图中蓝色条上方的化合物/药物浓度显示出抗SARS-CoV活性。因此，每个图形中的浅紫色区域表示有效化合物/药物浓度范围，相当于CPE检测中的均一结晶紫染色。经IMD-0354和CCT08159、PD102807、CD437、维甲酸、吲哚青碱、马普替林和喹啉等7种已鉴定的化合物/药物处理后，病毒RNA水平降低了10,000倍以上，与CPE检测结果一致。病毒RNA和CPE检测数据表明，要将病毒RNA减少到100倍(低于10⁶拷贝)，才能将CPE抑制到足以保持细胞附着的水平。MPA在SARS-CoV-2复制中抑制100倍，但在高浓度MPA抑制水平低于100倍的情况下，仍可观察到CPE(图1和图2)。重要的是，在所有测试的化合物/药物中，MPA的EC50(图2中的绿色虚线)最低(0.87μM)。吲哚青碱和IMD-0354在中高浓度对SARS-CoV-2表现出很强的抑制活性，在所测试的化合物/药物中显示出第二和第三低的EC50(分别为1.57μM和1.74μM)(图2)。

图2：药物对病毒RNA合成的影响。将SARS-CoV-2Wk521株(12株)与V-eroE6/TMPRSS2细胞单层细胞在含不同浓度药物的培养基中培养50h(MOI=0.01)。孵育50h后，从培养液中提取RNA，逆转录定量PCR检测SARS-CoV-2特异性RNA，如上所述。蓝条和红条分别表示抗病毒水平和细胞毒性水平，如图1所示。

本研究表明IMD-0354对SARS-CoV-2复制有抑制作用。IMD0354是一种IKKβ抑制剂，可阻断I-κBα磷酸化和NF-κB活化。虽然NF-κB被冠状病毒感染激活，刺激促炎细胞因子和趋化因子的产生，并促进冠状病毒的发病，但由于NF-κB是宿主天然免疫反应的关键转录因子，而冠状病毒本身又抑制NF-κB介导的途径，因此其抑制冠状病毒感染的机制尚不清楚。此外，在这项研究中，使用VeroE6/TMPRSS2细胞对Ⅰ干扰素相关基因缺失的IMD-0354进行了评估。IMD-0354具有一定的抗病毒活性，其作用机制可能与此无关。因此，IMD-0354抑制冠状病毒的潜在机制有待进一步研究。

MPA是一种肌苷一磷酸(IMP)脱氢酶抑制剂，在嘌呤生物合成中起关键作用。FDA批准的两种药物，咪唑立宾和霉酚酸酯都是衍生物。本研究显示MPA具有抗SARS-CoV-2的活性，与已报道的抗MERS-CoV的活性相似。以前的研究表明MPA抑制MERS-CoV木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)，该酶对病毒的非结构多蛋白进行蛋白水解以使其成熟。PLpro还有助于通过去泛素化来逃避宿主的先天免疫，干扰素调节因子3与抑制β干扰素(IFN-β)诱导。重要的是，对于MERS冠状病毒感染，MPA表现出低的EC50，在治疗剂量下很容易达到。因此，本研究建议将MPA与干扰素-β联合应用于临床治疗MERS冠状病毒，从而提高MPA的疗效。霉酚酸酯可以口服，MERS患者的临床和实验室研究结果表明，在他们的治疗中使用霉酚酸酯可以提高存活率。重要的是，在细胞培养和体内(小鼠)实验中，MPA几乎没有抑制SARS-CoV感染的作用。我们的CPE实验也未能检测到MPA的抗SARS-CoV-2作用，因为即使在高浓度MPA的抑制作用也不是很理想。然而，值得注意的是，MPA的EC50低至0.87μM，远低于霉酚酸酯治疗期间所达到的MPA血清水平。因此，类似于中东呼吸综合征冠状病毒的病例，值得考虑FDA批准的霉酚酸酯与其他有效药物联合治疗新冠肺炎的临床应用。

综上所述，本研究证实了MPA和IMD-0354的抗SARS-CoV-2活性。当SARS-CoV-2复制减少100倍以上时，我们的CPE法可以简便有效地用于抗SARS-CoV-2化合物/药物的筛选。IMD-0354具有较强的抑制作用，EC50较低(1.74μM)。虽然MPA对SARS-CoV-2复制的抑制水平不到100倍，但在低浓度下(EC50=0.87μM)表现出明显的抗SARS-CoV-2活性，这一水平很容易通过霉酚酸酯的治疗剂量达到。MPA具有抑制冠状病毒PLpro的作用，对MPA的进一步研究将有助于开发新型的抗SARS-CoV-2药物。

原文：doi: 10.1111/1348-0421.12828

原文：Antiviral activities of mycophenolic acid and IMD-0354 against SARS-CoV-2