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单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(样本制备)

已有 588 次阅读 2019-10-20 20:18 |系统分类:科研笔记

编者按:本文是Illumina团队出的NGS技术在单细胞研究中的应用,坊间以pdf的形式传阅,余以为多有不便,今摘抄于此。版权归原作者所有,侵删,内容仅供学习,更多详细信息请阅读原文。由于是综述文章,引用较多,这里为放方便阅读见,从略。

单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(应用篇一) 主要介绍单细胞技术在癌症、宏基因组学、干细胞、发育生物学、免疫学、神经生物学方面的应用。

单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(应用二),主要介绍单细胞技术在药物发现、生殖健康、微生物生态学和进化、植物生物学、法医学、等位基因 – 特定基因表达方面的应用。

分离单个细胞是单细胞测序工作流程的第一步,可通过多种技术实现。 189,190除现有的成熟技术(包括FACS、连续稀释、微量吸取和LCM)以外,微流体和基于液滴的技术增加了单细胞测序工作流程的通量,在单细胞数据分析中有更高的精确度和特异性。 191,192,193本节着重介绍一些用于从混悬液或组织分离单细胞的技术(表 1)。

表 1. 单细胞分离的方法

方法描述优势缺点成本
FACS使用电荷分离的带有单细胞的微滴细胞表面标记的特异性免疫标志提高了准确性• 高通量需要特异性抗体 /标记设备昂贵$$
连续稀释连续稀释至每孔一个细胞方法简单分离多个细胞的能力 不足$
口吸移液使用玻璃移液管分离单个细胞简单方法技术上困难$
自动显微操作自动微量移液管分离单个细胞高精确度低通量$$$
微流体平台微流体芯片分离流动槽中的细胞从小体积样本中分离细胞
高通量
要求细胞大小一致 、昂贵耗材$$$
光学镊离解的细胞悬液• 细胞分离集中可控
• 利用荧光标记细胞
• 技术困难
• 长期激光照射可损伤细胞
$$$
单核从组织匀浆分离细胞核并通过FACS分选• 柔和处理避免了基因\表达杂峰
• 高通量
• 无法检测出细胞质转本和小型 RNA$$
纳米过滤过滤器上的尺寸排阻过滤• 通过大小选择细胞• 细胞可粘附到过滤器上$
Mag Sweeper带EpCAM抗体的旋转磁铁• 可富集罕见细胞• 需要标记才可分离$$
显微操作离解的细胞悬液• 可从混合群体中分离多种细胞类型• 低通量• 需要较大的起始量$
TIVA201活的单细胞中的光激活mRNA捕获分子• 可兼容活组织,保留    单细胞微环境• 非侵入性• 低通量$$$
CellSearch含抗体偶联纳米粒的磁铁• 高通量• 对分离标记存在偏    向性$$$
CellCelector自动毛细管显微操作器• 高通量• 昂贵$$$
DEP-Array带电介质架的微芯片• 高灵敏度,可分离罕见细胞• 低通量 • 耗时$$$$
LCM在显微镜下通过激光从组织切片上切取细胞• 可保留空间信息• 技术困难   • 对 RNA/DNA 有潜在的UV损伤$$$

参考文献

  • Binan L, Mazzaferri J, Choquet K, et al. Live single-cell laser tag. Nat Commun. 2016;7:11636由于单细胞测序法通常会导致细胞裂解和空间信息丢失,因此找到可在单细胞基因组分析中保留空间信息的方法及其重要。作者研发了一种通过光致漂白的细胞标记(CLaP)法,将细胞标记与单细胞基因组结合起来。培养中的单个细胞通过激光光致漂白标记,然后基于大量不同特性分离。在本研究中,作者使用CLaP标记大量单层生长细胞系的不同细胞。研究使用基于液滴的微流体分离单个细胞,并使用HiSeq   2500系统执行RNA-Seq。将空间信息与单细胞基因组结合起来的能力使得该方法很好的适用于研究组织异质性。

    Illumina的技术:Nextera XT      DNA     Sample  Preparation     Kit、HiSeq      2500系统

  • Cottinet D, Condamine F, Bremond N, Griffiths AD, Rainey PB, et al. Lineage Tracking for Probing Heritable Phenotypes at Single-Cell Resolution. PLoS One. 2016;11:e0152395

确定单个微生物细胞的基因型和表型在了解微生物进化中至关重要。单细胞测序技术(包括WGS),当前可以高分辨率检测突变。但是,缺乏类似的表型分析方法。在本研究中,作者呈现了一种基于液滴的微流体系统,可在进化中的菌群中进行可遗传表型的遗传检测。在各种时间点间隔,研究采样细胞并在100       nL液滴中将其分离出来,随后使用荧光蛋白报告基因监测生长。作者使用该方法在 30 天的饥饿期间追踪大肠杆菌菌群。数据显示大肠杆菌的表型多样性随饥饿升高,而单细胞测序可确定每个表型类的相应突变。

Illumina的技术:HiSeq 2500系统

  • Bigdeli S, Dettloff RO, Frank CW, Davis RW and Crosby LD. A simple method for encapsulating single cells in alginate microspheres allows for direct PCR and whole genome amplification. PLoS One. 2015;10:e0117738

FACS后进行MDA,是当前单细胞样本处理的标准。由于高通量液体处理的试剂、耗材和设备成本升高,在单个孔中处理细胞可增加单细胞测序的成本。为降低平行单细胞测序的成本,作者研发了一种分离单细胞并大量制备DNA文库、随后分选的方法。研究将类球红细菌细胞包被到海藻酸盐微球中并进行MDA。研究将DNA从单个微球中提取出来,并使用MiSeq系统进行测序。该方法可改进从许多单个分离的细胞生成测序用DNA 的流程。

Illumina的技术:MiSeq 系统

  • Bose S, Wan Z, Carr A, et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing.  Genome Biol. 2015;16:120

在本研究中,作者展示了一种全新的可扩展的高密度微流体平台,可在玻璃盖玻片或多聚物微珠上固相捕获RNA。研究将单细胞裂解产物吸入密封的皮升微孔中,这些微孔可在玻璃上复印RNA或在小球上捕获RNA。研究将该样本制备方法与基于CEL-Seq的可扩展的scRNA-Seq技术结合起来。该技术相对便宜,耗材成本为每个细胞 0.10–0.20,并可平行处理数百个单独细胞。

Illumina的技术:TruSeq  RNA-Seq Library Preparation     Kit、NextSeq    500 和 HiSeq    2500 系统

+ Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, et al. Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) of RNA for gene expression profiling in intact cells and tissues. Nat Protoc. 2015;10:442-458

scRNA-Seq可分析整个细胞转录组的基因表达,但细胞分离通常会导致空间信息的丢失。原位杂交是确定基因标的位置的极佳技术,但限于固定数量的基因。在本研究中,作者展示了一种对细胞和组织中的基因表达进行原位分析的实验方案。此方法中,在共聚焦显微镜下,将RNA人工转化为交联的cDNA扩增子并测序。该方法添加了看家 / 结构基因环境特异性转录产物富集的益处,同时保留了转录位置的组织结构。

Illumina的技术:Nextera     XT      DNA     Sample  Preparation      Kit、MiSeq系统

+  Nishikawa Y, Hosokawa M, Maruyama T, Yamagishi K, Mori T and Takeyama H. Monodisperse Picoliter Droplets for Low-Bias and Contamination-Free Reactions in Single-Cell Whole Genome Amplification. PLoS One. 2015;10:e0138733

WGA是单细胞测序流程的关键组成部分,而MDA是单细胞测序中最常用的WGA方法。尽管使用广泛,由于扩展偏差和DNA嵌合体的形成,MDA通常产生不均匀的基因组覆盖。为克服该限制,作者研发了液滴MDA,将这些技术杂峰降到最低。研究使用微流体将提取的DNA片段分离到67      pL液滴中,而单个片段则随后使用MDA进行扩增。该方法通过测序大肠杆菌细胞的液滴MDA产物进行了验证,与使用传统MDA     59%的回收率相比,基因组回收率提高至 89%。

Illumina的技术:Nextera        XT      DNA     Sample  Preparation     Kit、MiSeq系统



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