A story of CRISPR/Cas9 (I)

不记得初次听说CRISR/Cas9这套系统是在什么时候，只是感觉在跨年这短时间内关于她的消息特别的多。第一条吸引我的消息是一个多月前本科同学Sugar在WeChat中分享的Moment（基因黑客张锋，原文来自《New Yorker》, By Michael Specter），接着在《STAT NEWS》里我又一次见到Feng Zhang和CRISPR的故事（Meet one of the world’smost groundbreaking scientists. He’s 34. By Sharon Begley），这些让我想起了去年夏天Dr. Q提到LRK对这个技术比较熟悉，做的不错；此外，还有一位同事也转到了CRISPR的领域。这就足以吸引我去看看她究竟是什么？能做什么？近期又为何有如此多关于她的消息?是什么样的技术可以在2012和2013年被《Science》评为年度科技突破，又在2015年占据榜首？我想走进去瞅一眼。

这是一项源自于细菌免疫系统、为基因编辑带来变革的技术。

——写在故事以前

“平均每两天，地球上一半的细菌会被噬菌体消灭，这是永恒的战役。”

——Vincent Fischetti, RockefellerUniversity

最早记录这项热门工具的报道来自1987年（正当我出生那年），人们发现在细菌基因的末尾有一些奇怪的、重复的序列，当时很少人注意到这一点。十多年后，基因组计划启动后的几年，人们解译了细菌的基因组，发现上述提到的令人疑惑的序列：一段序列后紧随与此反向序列，之后间隔~30或是随机的间隔序列后，这样的回文序列再次出现。单一的微生物体内存在多种这样的序列，只是重复序列、间隔序列不同。后来发现>40%的细菌，~90%的古细菌的基因组序列中分布着这样成簇的、规律间隔的短回文重复序列，即CRISPR（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat sequences）。

许多研究者认为这也是基因组内冗余的序列，没有什么功能。直到2005年由三个生物信息学的研究小组报道了这些间隔序列经常与噬菌体的序列高度匹配，直接暗示了这些序列可能是细菌免疫系统里的组成部分。Jennifer Doudna（University of California,Berkeley）也曾提到这是一条重要的线索。

在CRISPR的附近有4~10个cas（CRISPR-associated genes）基因，发现这个现象以后人们提出了多种设想。比如，2002年Eugene Koonin等人觉得这些基因或许编码了一种新的DNA修复系统。没过几年，他们提到当时有多个课题组的发现CRISPR内部的序列与噬菌体、外源质粒以及一些能穿梭于细菌的小片段DNA的序列很相似。果不其然，2006年3月16日，Koonin等人提出CRISPR内部在被感染早期从噬菌体获得的序列和Cas蛋白一起，构成一个细菌的免疫系统，抵抗后续噬菌体的感染、复制。并初步阐述这种机制像高等有机体内的RNAi：CRISPR内部的短的间隔序列（spacers）结合到与其互补的病毒的mRNA，阻止其指导翻译的同时，Cas蛋白可以将mRNA降解。

是的，这个猜测不久就得到了证实。

Danisco（现在已被DuPont收购）是一家依靠细菌生产奶酪、酸奶和蛋白质药物的公司，噬菌体的污染总是给他们的生产带来严重的麻烦。他们试着将细菌和噬菌体一起培养，扩增存活下来“被免疫”的细菌，该方法增强了细菌抵抗噬菌体的能力，是更“健康”的细菌。他们分析了“被免疫”的细菌中CRISPR内的序列，发现与噬菌体的序列相匹配。如果将这些间隔序列去除，便失去了抵抗噬菌体的能力，确实像高等生物RNAi的系统。这是首次在生物学上证实CRISPR的功能，也解释了为何细菌能抵抗病毒重复性的侵袭。

该公司的Dennis Romero感觉CRISPR除了靶向噬菌体外，可以有更广泛的应用，比如靶向染色体或质粒的序列等，这会帮助人们更好的操控细菌的基因活性。其实无论是否如此，CRISPR用于阻止（甚至调控、编辑）特异基因的活性（作为细菌内部的RNAi技术）已经指日可待，还可以通过基因水平的操作来改良抗噬菌体的细菌。可Danisco没有深入的研究，这受限于当时的GMO（genetically modified organisms）政策，由其是在欧洲。

“细菌获得性免疫系统”的概念已不胫而走，除食品科学家和微生物学家以外，引起了更多人的兴趣，人们看到了前景：她可以靶向特异的DNA序列。2013年1月，四组独立的研究团队同时报道了应用CRISPR技术破坏人源细胞内部的基因。接下来的八个月，人们应用该技术成功的删除、插入、激活或抑制了人、鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫、玉米等模式生物细胞内部的靶向基因，充分显现了她广泛的应用范围。后续生物学家发展了这项技术，得以更精确的靶向目标基因，她的高效率和简易的操作藐视了其他基因编辑的技术。

在看到这些之前，人们没有想到这份原件在基因编辑领域会有如此光明的前景，一切惊喜来的是那么的快！下面让我简单描述如下的两篇重量级的文章，她们向全世界呈现了CRISPR/Cas9在基因编辑领域不可估量的前景。

ElitzaD, Krzysztof C, Sharma C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded smallRNA and host factor RNase III.[J]. Nature, 2011, 471(7340):602-607.

不久人们已经知道RNA介导的宿主防御系统主要分为三步：1），获取部分外源DNA（噬菌体或质粒），整合入CRISPR区域；2），表达pre-CRISPR（也就是CRISPR的前体），包含“重复序列-间隔序列”；3），干扰外源基因的作用（具体机制还不清楚）。Pre-CRIPSR成熟的过程（有效的剪切过程）是关键的一步，产生正确的CRISPR才能发挥后续的功能。2010年时人们已经知道有三种Cas蛋白（Cse3， Cas6和Csy4）可以剪切pre-CRIPSR，然而有心人分析了成熟的CRIPSR，发现他们的同源性并不高。这便意味着剪切的过程不是唯一的，还有其他的通路或方式。

早在2010年，Emmanuelle Charpentier的团队发现crRNA的成熟需要tracrRNA（trans-activating CRISPRRNA，首次命名）和宿主细胞RNase III的协助。这里主要依靠于dRNA-seq（differential RNAsequencing）和该团队多年研究RNA的丰富经验。通过序列分析，作者看到了CRISRP附近同样转录了一个稍稍长的RNA片段（171 bp和89 bp），他们起始于与CRISPR互补的另一条DNA链（故称为反式），其内部有~25 bp的序列和CRISPR近乎完美互补（仅一个碱基的差异），并且两条RNA的剪切位点在预测的二聚化区域，直觉告诉她们这样的剪切是同时进行的、这样的互补是有功能的。接下来的缺失实验证实了这样的猜想，这也是首次报道细菌内一条非编码的RNA调节另一条非编码的RNA的合成。此外，Charpentier等人看到RNA剪切后的位点和RNaseIII、真核的Dicer和Drosha等内切酶的作用位点一致。由于Cas蛋白并未发现有此模序，于是顺藤摸瓜，敲除编码RNaseIII的基因（rnc），结果crRNA和tracrRNA未发生剪切，体外酶切实验也证实了这一点。原来，除Cas蛋白意外，宿主还有其他组份参与CRISPR的成熟过程，同时发现了Csn1也扮演重要的角色（不到一年，他便被更名为“Cas9”）。就这样，这套基因编辑的系统里主要的成分被拎了出来：RNaseIII， Cas9， tracrRNA和crRNA，无论是在细胞内、细胞外她们都可以特异的切割环状或是线性的DNA。

《Nature》于2011年初发表了该文章。之前人们一直以为CRISPR与“邻居”一起行使功能，RNaseIII的发现让人们联想到：是否也存在其他组份，能够更好、更快的改善这套免疫系统呢？接着就是下面这篇更为精要的文章，来自Doudna和Charpentier的课题组：

MartinJ, Krzysztof C, Ines F, et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonucleasein Adaptive Bacterial Immunity [J]. Science, 2012, 337(6096):816-21.

当时人们将CRISRP/Cas系统简单分为三种类型：I和III型由特异的Cas蛋白接到，他们与成熟的crRNA自组装成复合物来剪切与CRISPR互补的DNA；相比而言，II类型有些特别：除Cas9蛋白以外，还需要tracrRNA介导RNaseIII切割pre-crRNA，产生成熟的crRNA再行驶靶向切割的功能。这篇文章发现了Cas9需要两条RNA的引导、发现了PAM（protospacer adjacent motif）、发现了Cas9中的两个具有酶切活性的结构域（甚至是负责分别切割DNA两条链的结构域）、并且证实了一条融合“crRNA和tracrRNA”的RNA同样可以介导Cas9对DNA的靶向切割。这些发现指向一个更让人惊讶的方向——可以操控Cas9靶向切割任何一个感兴趣的基因，甚至，编辑宿主的基因组（这就是里程碑式的文章，怎能不让人看到这一则消息的人们兴奋！）。

发现Cas9蛋白是非常关键的，这一家族中有许多成员，大家都需要crRNA和tracrRNA的帮忙才能切割DNA，但是他的具体作用还没有被阐明。作者纯化了原核表达的的Cas9蛋白（Streptococcus pyogenes），与成熟的crRNA共孵育，并未发现切割DNA的现象。若此时加入tracrRNA，在不到一分钟的时间内，特异性的切割现象便发生了，就在PAM上有~3bp的地方。此过程不仅需要Mg²⁺的参与，还需要crRNA和DNA 有互补的序列。到此，tracrRNA已有两个关键的功能：辅助RNaseIII促使crRNA的成熟，辅助Cas9特异切割DNA。

Cas9蛋白存在HNH和RuvC（DNA内切酶）的同源结构域，突变其各自功能后作者发现每个结构域负责切割DNA的一条链（赞！原来RNA的实验已可以精确到每个碱基、每一条DNA链）：HNH结构域切割与crRNA互补的DNA链，RuvC结构域切割非互补的DNA链。

之后作者又探讨了tracrRNA是帮助Cas9结合到DNA上，还是辅助Cas9切割DNA。EMSA实验结果倾向于前者，或许是crRNA中的互补序列将他们带了过去。接下来的实验就更为细致：不同长度、不同位置的tracrRNA和crRNA的作用。这一实验锁定了PAM的位置、功能，和crRNA关键互补序列的数目、位置，这些发现就是现在我们还在遵循的crRNA设计规则（其实这就已经隐含了脱靶效应，off-target）。接下来的RNA融合实验就不难理解，只是这个主意太棒了！作者证实了单链嵌合的RNA（包含tracrRNA、loop和crRNA）可以介导Cas9对DNA的切割。这是典型的“基础研究”转向“应用”的案例。知道每一个组分的功能，剩下的工作就是简化这项程序。

到此，CRISPR/Cas9已经成型，一套广泛存在于细菌内部的免疫机制关键部分已被揭开，那时是2013年。之后的两年，直到现在，CRISPR/Cas9就像是起飞的雄鹰，飞向了广阔的天空，各项应用如雨后春笋般接连被报道（包括张峰等人的研究）。这项技术的前景如何？潜在的危险有哪些？目前的进展如何？我想继续跟踪一下。

后记

首先，像如此优秀的科学家表示敬意！有些人从开始关注CRISRP开始，至今依然潜心研究十余年，甚至更久。在这些见诸报道的背后，隐藏了太多的失败、挫折、重复；如此缜密、精密的实验让我很是赞叹。该项技术的应用前景，或许可以与当年DNA双螺旋结构、PCR相媲美，让人很期待后续的研究成果。

记得在初次看到CRISPR/Cas9的时候，我第一感觉是这应该与Cre/Lox P类似，一个是酶、一个是靶点（我对这两个技术都不了解）。后来发现，不仅如此，她还与高等生物体内的RNAi也非常像：短的双链RNA，外加一个内切酶（只是用来切DNA，也有报道显示可以切RNA）。没有阅读更细的文章，只是挑了些关键的报道浏览一番，对如何设计、操作这项技术还不甚了解（若是日后有相关项目，倒是可以跟踪、练习一下）。

这项技术的发展并非是一件漫长的过程，几乎每一年（甚至每个月）都可以看到有新的研究。只是感觉整个过程是非常严谨的，没有前人对各个宿主细菌、对多种Cas蛋白的研究，变不会发现Cas9这个蛋白。测序能力的提升和转录组学的研究给人们很大帮助，如今已经具备了直接分析RNA片段或碱基功能的能力，一些新的发现也会随之而来。有时真的感觉这种发展就像是自然界的一种进化：全世界人们会集中力量搞科研，这是一项群体的工作。不论是Jennifer还是Feng，都仅是这个群里的一员，即使没有他们，CRISPR的专利也会有其他人提交。模糊的感觉这是一种技术自身的进步，而我们仅仅是这漫漫过程中的一种媒介。

TJ, Pharmaron

2016年1月11日星期一