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反式调控单细胞CRISPR筛选的因果效应估计

已有 256 次阅读 2026-7-5 21:42 |个人分类:科普|系统分类:科普集锦

反式调控单细胞CRISPR筛选的因果效应估计

自单细胞测序技术出现以来，研究人员已经能够评估外部干预（例如药物）对大量基因的细胞类型表达的影响。基于外部（细胞外）干预的方法极大地扩展了我们对细胞生物学和生理学的认识，而建立基因扰动（例如基因敲低）与特定细胞类型中其他基因表达水平之间的因果关系则变得越来越重要。传统上，基因关系是通过分析基因共表达模式来近似的。然而，这些关系是由相关性而非因果关系定义的，因此很难对它们进行因果解释。

最近，由于基因编辑技术的快速发展，将池化 CRISPR 筛选与单细胞转录组读数相结合（此处称为单细胞 CRISPR 筛选）为绘制扰动与基因之间的因果关系提供了重要进展（图 1A 和 1B）。存在多种单细胞 CRISPR 筛选方法，包括靶向 Perturb-seq、使用 CROP-seq 进行直接捕获的 Perturb-seq 和相关方法，这些方法通常统称为 Perturb-seq。单细胞 CRISPR 筛选可分为顺式调控和反式调控。顺式调控单细胞 CRISPR 筛选针对基因组中的调控、非编码部分，以研究顺式调控机制。本简评的范围专注于基于反式调控单细胞 CRISPR 筛选数据的因果效应估计。

图1 从 CRISPR 扰动到因果解释和信号通路。(A) dCas9–KRAB CRISPR 干扰系统的示意图：催化失活的 Cas9 与 KRAB 抑制因子融合，被 gRNA 招募到目标基因的启动子区域，导致其转录受到抑制。(B) 池化 gRNA 文库输送至细胞群体的示意图，其中每个细胞理想情况下随机接收一个 gRNA 并成功结合到所需的转录位点。(C) 三个基因（U、V 和 W）的观察性关联图，说明仅通过观察性表达数据，难以推断潜在的因果关系。(D) 单细胞 CRISPR 筛选中如何使用靶向基因 U、V 和 W 的 gRNA 来敲低每个基因（例如基因 U），随后测量其他基因（例如基因 V 和 W）的表达变化以进行因果效应估计的示意图。(E) 推断敲低基因 U、V 和 W 的因果效应的解释。从干预数据中推断的理想目标是推断 U、V 和 W 之间的因果关系，其中可以通过测量敲低某一基因对另一基因的因果效应来推断两基因之间的因果效应。然而，在本文提出的假设下，只能识别一个基因对另一个基因的敲低效应，而不能直接识别两个基因之间的因果关系。(F) 概念图示：如何利用估计的因果关系重建蛋白质水平的信号转导通路，将遗传扰动与下游分子通路结构联系起来

在反式调控 CRISPR 筛选中，会构建一个引导 RNA（gRNA）库，其中包含多个 gRNA，每个 gRNA 通常靶向基因的转录起始位点。由此产生的基因表达变化能够用于研究调控基因表达的反式调控机制。通常，同一个靶基因会包含多个 gRNA。在低感染倍数（MOI）的单细胞 CRISPR 筛选版本中，gRNA 库被递送到细胞培养物或组织中，目的是每个细胞引入一个 gRNA，从而形成一个每个细胞携带不同 gRNA 的细胞群体。高 MOI 版本旨在增加每个细胞获得的信息量，从而提高实验的可扩展性。这些为组合型单细胞 CRISPR 筛选，但在文献中有时也称为高 MOI 单细胞 CRISPR 筛选。这一区分在单细胞 CRISPR 数据分析中是相关的，并可能影响所使用的方法。在本篇简短综述中，重点关注单引导 RNA 单细胞 CRISPR 筛选。

在 gRNA 池构建过程中，gRNA 被递送到表达 dCas9 的细胞中。dCas9 是一种催化失活的 Cas9 变体，可以结合 DNA 但不切割它，它利用递送的 gRNA 定位目标基因的转录起始位点。dCas9 与能够增加（CRISPR 激活/CRISPRa）或减少（CRISPR 干扰/CRISPRi）基因表达的效应蛋白融合。

在 CRISPRa 实验中，dCas9 通常与 VP64 融合，VP64 是一种强效的合成转录激活结构域，它招募通用转录机制，导致目标基因表达增加。在 CRISPRi 实验中，dCas9 通常与 KRAB 抑制结构域融合，它招募染色质重塑蛋白，导致更紧密的染色质结构。染色质结构，从而降低了目标基因的表达。最后，使用专门的单细胞转录组学方案对细胞培养或组织进行测序，该方案不仅测序每个细胞的 mRNA，还测序给定细胞中存在的 gRNA。本简述的重点是结合单细胞转录组学的 CRISPRi 实验。

在统计估计中，变量之间的关联通常被视为分析的一个充分结果。但对于因果效应估计而言，情况并非如此，因为因果推断才是分析的目标。重要的是，如果没有额外的因果假设，统计方法无法产生可解释的因果结果，而这些假设需要在实验设计和后续数据分析的背景下进行考虑。值得注意的是，如果不引入干预措施来帮助防止虚假关联被误读为因果效应（图 1C），仅依赖观察测量是困难的。正是通过这种方式，单细胞 CRISPR 筛选才有可能使研究人员能够绘制基因之间的因果关系。

现有的综述已经提供了关于单细胞 CRISPR 筛选分析方法的广泛概述，或专注于机器学习和因果结构学习应用。尽管以往研究已提及因果假设，特别是在结构学习方面，但缺乏对无偏因果效应估计所需假设的更广泛综述，尤其是那些不一定与特定参数模型或统计分析方式相关的假设。由于有效的因果假设对于一致地估计扰动与基因之间的因果效应至关重要，因此这是当前实践中一个关键的空白。

这里，Christensen等人首先总结反式调控单向导单细胞 CRISPRi 筛选（以下简称“单细胞 CRISPRi 筛选”）的因果推理基础。接着，介绍常用的因果效应估计假设——一致性、无干扰、条件可忽略性和正性，并讨论其相关性以及在单细胞 CRISPRi 筛选中的潜在违反情况。随后，简要描述分析此类筛选的现有方法的统计特性。通过一个实例，说明了基础数据生成过程满足足够数量的因果假设对于实现无偏因果效应估计的重要性。最后，作者们提供了未来工作的展望。

参考文献

[1] Christensen OP, Markham A, Kang H, Gabriel E, Pers TH. Causal effect estimation from trans-regulatory single-cell CRISPR screens. Cell Genom. 2026 Jun 10;6(6):101251. https://doi.org/10.1016/j.xgen.2026.101251

以往推荐如下：

1. 分子生物标志物数据库MarkerDB

2. 细胞标志物数据库CellMarker 2.0

3. 细胞发育轨迹数据库CellTracer

4. 人类细胞互作数据库：CITEdb

5. EMT标记物数据库：EMTome

6. EMT基因数据库：dbEMT

7. EMT基因调控数据库：EMTRegulome

8. RNA与疾病关系数据库：RNADisease v4.0

9. RNA修饰关联的读出、擦除、写入蛋白靶标数据库：RM2Target

10. 非编码RNA与免疫关系数据库：RNA2Immune

11. 值得关注的宝藏数据库：CNCB-NGDC