狂犬病毒中和抗体的检测与定量：现状与展望（2）

前言（ii )

迄今为止，狂犬病毒中和抗体（VNA）的检测方法中只有两种被认为是狂犬病血清学的金标准( gold standard)方法，并被世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)推荐： 快速荧光灶抑制试验（RFFIT，rapid fluorescent focus inhibition test)和荧光抗体病毒中和试验(FAVN，fluorescent antibody virus neutralization)。这些方法旨在模拟体内实验，使用BHK-21细胞，该细胞对RABV（狂犬病毒）感染高度敏感(图2)。

这两种方法的主要区别是对结果的解释:在前者,每个血清稀释度被感染的荧光灶的数量被用来计算ED50(50%有效剂量)的中和效价，如果检测中包含有参考标准品( reference standard)，则可将结果转化为国际单位/毫升（ IU/mL）(图2A),而后者的结果表示为“全有或全无”。在后一种方法里，BHK-21细胞被培养在96孔细胞培养板上，而不是RFFIT试验中使用的8孔室（chambers）细胞培养载玻片;随后，根据感染细胞是否存在，每孔分别被标记为阳性或阴性，再计算结果，从而提高了检测结果的准确性和质量(图2B)。

这些VNA测试有几个缺点，因为它们不容易标准化，需要使用活的RABV、需要有达到一定生物安全级别的实验设施和熟练的专业人员等等。

因此，有必要开发替代技术来评估狂犬病控制和监测的结果。目前经优化和改进的ELISA检测法已被接受为检测抗狂犬病糖蛋白抗体(Ab)的可选方法，它已能保证结果的一致性并能在更短时间内完成。

图2.   血清中和试验的金标准（Gold standard）。

 A.  RFFIT（快速荧光灶抑制试验）. 

(1) 之前稀释的血清样品与固定数量的RABV (CVS 11株)混合在8孔室载玻片。

(2) 中和时间结束后，加入BHK细胞悬液，培养20 - 24小时。

(3) 清洗和固定。

(4) 异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）交联的抗RABV 抗体用作读取结果的荧光显示系统。

(5) 结果读数使用荧光显微镜。

(6) 荧光在细胞中的存在与未被中和的RABV的数量成正比。,

(7) ED50中和效价被定义为特定的血清稀释度，此时50%的显微镜视野中含有一个或多个被感染细胞。

B.  FAVN（荧光抗体病毒中和试验）.

（1） 连续稀释的血清样本与固定数量的RABV (CVS 11株)混合在96孔微孔培养板上。

(2) 中和时间结束后，加入BHK细胞悬液并孵育48 h。

（2） 清洗和固定。

（3） 使用FITC（异硫氰酸荧光素）交联的抗RABV 抗体作为检测系统。

(5) 使用荧光显微镜读取结果。

(6)  如果没有观察到信号，则认为该孔为阴性。相反，如果观察到一个或多个荧光细胞，则认为该孔为阳性。

(7) 计算ED50中和效价。

事实上，有几项研究仅基于检测和量度抗G蛋白抗体，就证明了这些检测和VNA测试之间有良好相关性。因此，本文描述了目前用于狂犬病血清学的作为金标准试验替代的最先进的分析方法，同时考察了其他新的重组VNA试验方法，以及范围广泛的抗原结合试验。

这些都是快速测量抗狂犬病糖蛋白抗体的有用工具，在某些情况下，比金标准方法更简单、更通用。然而，在选择最合适的方法之前，确定适当的检测目的是必要的。

（未完待续）

参考文献

Rodriguez MC, et al., Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Sep;105(18):6547-6557. DOI: 10.1007/s00253-021-11515-4