狂犬病毒中和抗体的检测与定量：现状与展望（1）

摘要

狂犬病是一种古老的致命疾病，除了暴露后接种疫苗外，没有其他可用的治疗方法。受感染动物(主要是狗)的咬伤是其传播给人类的主要原因。在此背景下，全球伴侣动物疫苗接种运动以及野生动物宿主疫苗接种是实现2030年消灭犬类引发的人类狂犬病计划的关键因素。该计划的英文简称是 “Zero by 30”，即到2030年因狗引发的人类狂犬病的发病率为零。

狂犬病毒中和抗体(VNA)在针对狂犬病的免疫保护中发挥着重要作用，因为它与充分的免疫反应相关，并可用于评估暴露前或暴露后的预防效果。因此，采用可靠、准确和稳定的血清学检测试验是至关重要的。目前，RFFIT和FAVN是世界卫生组织和世界动物卫生组织推荐的VNA检测的金标准。尽管这些方法是有效和广泛使用的，但它们也存在一些缺点，因为它们不太容易标准化，需要使用活的狂犬病毒、达到一定生物安全级别的实验设施和熟练的专业人员。

在本文中，将简介目前可用的最先进的狂犬病血清学分析方法，包括基于假型重组病毒（ pseudotyped recombinant viruses）的新方法，并特别强调了检测和量化抗狂犬病毒糖蛋白抗体的抗原结合方法。本文讨论了广泛的测定方法，这些方法是快速测定抗狂犬病毒糖蛋白抗体的有用工具，在某些情况下，比金标准方法更简单和更通用。最后讨论了酶联免疫吸附试验（ELISA）设计和优化过程中的关键问题，强调了验证（validation）和标准化程序（ standardization procedures）对改进狂犬病血清学试验及其结果的重要性。

本文要点：

对狂犬病血清学检测方法进行全面综述。

从所有的意向和目的来看，没有一种狂犬病血清学检测方法可以被认为比其他方法更好。

验证程序保证了全球范围内可靠和一致的结果。

关键词：狂犬病（Rabies）、血清学试验（Serology test）、糖蛋白（Glycoprotein）、中和抗体（Neutralizing antibodies）

前言（i )

纵观人类历史，人畜共患病已成为公共卫生面临的最大挑战之一。据估计，在全球范围内，每年约有10亿例严重病例和数百万人死于人畜共患病。2019冠状病毒病(COVID-19)大流行的爆发并非巧合，其原因是野生动物的环境条件发生变化，以及为满足不断增长的人口需求而开发自然资源。特别是狂犬病是世界上最致命的人畜共患病之一，死亡率接近100%。这种疾病是由弹状病毒科、丽沙病毒属的病毒引起的，每年在150多个国家造成4万至6万人死亡，95%的病例发生在非洲和亚洲(世界卫生组织2018年)。主要的传播机制是通过动物的咬伤，通过被感染宿主的唾液传播。首先，该病毒感染周围神经，然后转移到中枢神经系统（CNS）。然而，尽管狂犬病一旦出现症状就会致命，但由于病毒进入和临床疾病发展之间的潜伏期相对较长，它是可以预防的。因此，狂犬病暴露后预防(PEP)、家畜和野生动物宿主的疫苗接种和人类暴露前预防(PREP)是缓解和控制狂犬病的主要策略(图1)。

图1  狂犬病毒感染、暴露前预防(PREP)和暴露后预防(PEP)在狂犬病控制和预防中的重要性。

PREP和PEP主要是基于对个体的疫苗接种，以诱导免疫反应，抗体在控制感染中发挥核心作用。此外，人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)经常在PEP方案中配合使用。

狂犬病免疫反应包括细胞免疫和体液免疫; 然而，人们认识到病毒中和抗体(VNA)对预防狂犬病毒(RABV)感染至关重要。RABV是一种包膜病毒，其糖蛋白(G)固定在病毒膜上。G是该病毒唯一的一种表面蛋白，也是已知的唯一能够诱导VNA产生的病毒产物。

VNA与病毒相互作用，阻断病毒进入细胞，阻止(或减缓)感染过程。因此，VNA含量的测量很有意义。狂犬病血清学测试是确定感染后获得性免疫反应和人类和野生动物疫苗接种活动有效性的宝贵工具。

病毒中和试验(VNA)是基于细胞或体内的试验，检测血清、血浆或脑脊液中抗体对抗活病毒的功能活性。第一个用于量化狂犬病VNA的实验是1935年最早进行的小鼠中和试验(MNT) ，这是一种体内实验，在小鼠大脑内定量接种有活力的RABV，接种前曾与系列稀释的血清样品一起孵育。样本中VNA的水平可以从接种动物的存活率中得到证明，其中较高的存活率与较高的VNA滴度有关。

由于涉及活体动物，使用的分析方法的技术复杂性、标准化难度以及替代动物使用(3R原则)的趋势日益增长，除发展中国家的一些实验室外，采用活体动物的实验已在世界各地的许多实验室被取代。

（未完待续）

参考文献

Rodriguez MC, et al., Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Sep;105(18):6547-6557. DOI: 10.1007/s00253-021-11515-4