本周的精读文献为，通过DNA聚合酶处理核碱基修饰的核苷酸的结构见解。

文章以KlenTaq DNA聚合酶为例，介绍了酶与引物模板DNA和几个修饰过的核苷酸三元复合物的晶体结构分析，首次提供了核苷酸修饰过程的结构见解。有些地方我不太能读懂，这次的精读文献仅对我看懂的部分加以总结。

DNA聚合酶催化的修饰核苷酸的掺入用于许多重要的生物技术，例如下一代测序，基于核酸的诊断，转录分析和通过指数扩增系统富集配体的适体选择。最近的研究表明，在核碱基上通过修饰功能化的2'-脱氧核苷三磷酸（dNTP），如染料，亲和标签，自旋和氧化还原标记，甚至寡核苷酸，都可以成为DNA聚合酶的底物，即使进行了修改。在核苷酸中引入修饰的位置对于保持DNA聚合酶的底物活性是至关重要的。修饰通常附着在嘧啶的C5位置和7-脱氮嘌呤的C7位置。此外，已经表明，修饰的性质可能影响DNA聚合酶将修饰的核苷酸掺入新生DNA链的效率。本文将DNA聚合酶修饰核苷酸结合研究中获得的功能数据与最近获得的结构数据结合起来。以KlenTaq DNA聚合酶为例，发现KlenTaq DNA聚合酶处理大体积的修饰，是因为蛋白质中的空洞能够使修饰延伸到活性位点之外。此外，我们发现该酶能够以灵活的方式适应不同的修饰，并且根据核苷酸修饰的性质在活性位点采用不同的氨基酸侧链构象。有趣的是，还发现当3'引物末端也是修饰的核苷酸而不是未修饰的天然核苷酸时，KlenTaq DNA聚合酶可以更有效地处理修饰的核苷酸。

关于DNA聚合酶研究及其与修饰核苷酸相互作用的报道强烈表明，修饰的位置和修饰的类型在DNA聚合酶接受修饰的核苷酸中起着重要作用。原则上，可以在糖部分，磷酸盐和核碱基中引入修饰。虽然核碱基修饰的处理效率最高，但糖和磷酸盐的修饰耐受性差。原则上，适用于修饰的位置是嘌呤的第7或8位和嘧啶的5或6位，因为它们不影响Watson-Crick碱基配对，并且很好地适应DNA双链体的主要沟槽（图1）。

图1 2'-脱氧核苷三磷酸和Watson-Crick碱基对的结构，虚线表示氢键。

最近的研究表明，碱基修饰DNA的酶促合成几乎完全由在C5修饰的嘧啶和在C7修饰的7-脱氮嘌呤进行。这主要是由于这些类似物不仅在引物延伸（PEX）中，而且在聚合酶链反应（PCR）中显示出了优异的底物性质。新的观点源于这样的事实：与天然dNTPs相比，某些在这些位置被修饰的dNTPs甚至可以作为增强的结合底物。相反，在嘧啶的C6或嘌呤的C8处修饰的核苷酸不太有利于DNA聚合酶的掺入。小的取代基如8-溴 - 和8-甲基-dATP是DNA聚合酶的合适底物，而相应的8-苯基修饰体太大而不能掺入。

在KlenTaq DNA聚合酶中，通过重新定向O-螺旋，手指结构域将其构象从开放状态改变为闭合状态，以产生活性酶 - 底物复合物。

在一些情况下，属于B族的古菌DNA聚合酶（即来自Thermococcus sp.9°N-7（9°N），Thermococcus kodakarensis（KOD）和Pyrococcus furiosus（Pfu））似乎比来自A家族的酶，例如Taq DNA聚合酶更适合于掺入核碱基修饰的核苷酸。这种优先接受修饰底物的原因尚未阐明，主要是因为缺乏结构数据。沿着这些方向，文章还研究了两种DNA聚合酶的二元结构，这两种DNA聚合酶广泛用于掺入修饰的底物，即KOD和9°N DNA聚合酶。

家族B DNA聚合酶分为手指，拇指，手掌和N-末端结构域，例如在KlenTaq DNA聚合酶中，并具有另外的3'-5'核酸外切酶结构域。 处于开放状态的整体结构是具有中心孔的圆形构造，该圆孔在闭合状态中被手指区域堵塞。 开放二元复合物结构显示，DNA双链结合区在由拇指和手掌结构域形成的凹槽中。

KOD DNA聚合酶二元结构中的双链采用B型DNA构象，大多数2'-脱氧核糖部分显示出对B-DNA（C2'-endo）的理想折叠。这与在KlenTaq DNA聚合酶中的插入位点附近以及在其他A家族成员如T7或Bst DNA聚合酶中观察到的A型DNA相反。与A型DNA相比，B型DNA更加伸长，具有宽开口的大沟，因此家族B DNA聚合酶中的DNA双链构象可能有利于接受修饰的底物。

随着KOD和KlenTaq DNA聚合酶结构的揭示，发现大多数直接蛋白质 - 双链DNA相互作用是通过磷酸骨架介导的。虽然这两种酶的接触量相似，但观察到与核碱基或糖接触有关的显着差异。六个DNA核碱基与KlenTaq DNA聚合酶的五个氨基酸侧链相互作用，而只有五个核碱基与三个KOD DNA聚合酶残基相互作用。此外，与KOD DNA聚合酶相比，KlenTaq DNA聚合酶还具有氨基酸侧链与2'脱氧核糖部分的另外四种碱基直接相互作用。由于这些糖和核碱基接触位于小沟中，人们会期望B族DNA聚合酶的空间位阻较小。然而，一般而言，无论DNA聚合酶家族如何，DNA小沟都被比大沟更多的蛋白质残基所覆盖，因此阻碍了在小沟内进一步引入庞大的修饰。

此外，在拇指结构域中发现了两个DNA聚合酶家族之间的进一步差异。在两种情况下，拇指结构域的尖端（KlenTaq DNA聚合酶中的残基506-509和KOD DNA聚合酶中的668-675）与引物链相互作用，但接触区域从一种结构到另一种结构的差异很大。KOD DNA聚合酶结构中的接触区域位于小沟上方，与磷酸盐骨架相互作用，而KlenTaq DNA聚合酶中的相应区域从磷酸骨架上延伸到大沟中。因此，当使用KlenTaq DNA聚合酶处理时，嘧啶中的C5和位于主槽中的7-脱氮嘌呤C7的修饰可能与拇指结构域的尖端发生冲突。这些结果可以解释家族B DNA聚合酶在掺入修饰核苷酸方面的更好效率。

文章主要介绍了关于不同聚合酶结构方面的知识，没有具体的实验操作，是把有关实验的结果汇总到了一起，对我以后撰写论文的综述部分有很大帮助。

文献出处：Acc Chem Res. 2016 Mar 15;49(3):418-27. doi: 10.1021/acs.accounts.5b00544. Epub 2016 Mar 5.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26947566/