本周精读的文献为，通过新型KOD聚合酶突变体连续掺入具有多个侧链的官能化核苷酸。

文章主要介绍了一种KOD聚合酶突变体KOD exo / A485L，该种聚合酶能够以两亲性基团作为底物有效地接受修饰的核苷酸。可以连续的掺入超过50nt的dN^amTP，具体是7-取代的7-脱氮嘌呤核苷三磷酸和5-取代的嘧啶核苷三磷酸，这表明该突变体足以产生功能性核酸分子。

这项研究的目的是构建修饰的寡脱氧核糖核苷酸（ODN），ODN是分子生物学，临床诊断及应用的重要工具，短的ODN可以通过化学的方式合成，而长一点的则需要使用聚合酶合成，但市面上现有的酶KOD Dash进行扩增最多限制在15个核苷酸，不足以产生功能性ODN，故开发了一种新型的聚合酶突变体来用于合成。

古细菌家族B DNA聚合酶与家族A DNA聚合酶相比能有效地掺入含有修饰的核碱基或糖残基的核苷酸。近几十年来已经产生了各种热稳定古细菌家族B聚合酶变体，如TherminatorTM DNA聚合酶，A485L的9 N DNA聚合酶的突变体，A485L位于聚合酶的手指结构域，但该残基可能不直接与进入的dNTP相互作用。有人认为这种突变会影响构象转移，从而将进入的核苷酸传递到活性位点。KOD聚合酶和9 N聚合酶在序列和结构上相似（同一性：91％），而它们在保真度上非常不同。9 N及其突变体通常仅用于常规PCR或掺入修饰的底物。KOD聚合酶及其突变体不仅用于修饰的ODN的延伸，故在KOD相同的位置上进行突变，构建KOD exo / A485L突变体。并进行了引物延伸（PEX）（图1）。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析反应产物（图2）。

图1 引物延伸dN^amTP

图2 （A）延伸温度为74℃时扩增情况，（B）延伸温度为37℃时扩增情况

Lane 1: primer only; 

Lane 2: reaction using KOD pol. (WT); 

Lane3: reaction using KOD pol. exo; 

Lane 4: reaction using KOD Dash (mixture of WT and exo(1:40));

 Lane 5: reaction using KOD exo/A485L.

如图2A所示，KOD exo / A485L在74℃的反应温度（泳道2-5）下表现出比其他更好的性能。但是，未生产全长产物（+38nt）。在先前的工作中，包含dN^amTP的双链DNA显示出低的双链热稳定性，修饰的ODN能够在37℃下在水性缓冲液中形成稳定的双链。接下来，在25,37,50或74℃下进行PEX以研究反应温度对聚合酶活性的影响。发现KOD exo / A485L在37 C时表现最佳。因此，我们重新评估了相同聚合酶在37℃下掺入四种修饰的三磷酸盐（图2B）。尽管由于修饰的ODN的长度过长而难以精确计数修饰的核苷酸残基的数量，但是KOD exo / A485L可能产生全长产物（泳道5）。这些结果表明应该可以使用KOD exo / A485L掺入具有相对低熔点的经修饰的核苷三磷酸。

随后，使用几种不同长度的模板（+ 20,40,50或54聚体）来确定在PEX实验中通过KOD exo / A485L掺入了多少修饰的核苷酸（图3）。

图3 使用不同长度的模板进行PEX实验

Lane 1: primer only;

Lane 2–5:reaction containing each+20，+40，+50，+54-mer template

由+ 54-mer模板制成的经修饰的ODN产物显示出比由+ 50-mer模板产生的略低的迁移率。该结果表明至少50-mer-修饰的ODN通过KOD exo / A485L（泳道4和5）聚合。该长度足以通过体外选择或涉及ODN链扩增的SELEX（通过指数富集的配体的系统进化）产生DNA酶或配体。在任何模板中，扩展序列包含所有可能的两碱基序列组合(4² = 16)，这表明KOD exo /A485L可以接受各种序列中的dN^amTP。

聚合酶应该能够有效且准确地掺入修饰的核苷酸。因此，比较了KOD exo / A485L的效率和保真度与含有相似突变的TherminatorTM（9 N聚合酶exo / A485L）的效率和保真度（图4）。

图4 在没有任意一种或所有dNamTP的情况下引物延伸以评估KOD exo / A485L的保真度。

Lane 1: Primer only; 

Lane 2, 4, 6, 8, 10: 0.4 U/lL Therminator; 

Lane3, 5, 7, 9, 11: 20 ng/lL KOD exo
/A485L; 

Lane 2, 3: reaction containing dCamTP,dGamTP, and dUamTP; 

Lane 4, 5: reaction containing dAamTP, dGamTP, and dUamTP;

Lane 6, 7: reaction containing dAamTP, dCamTP, and dUamTP; 

Lane 8, 9: reactioncontaining dAamTP, dCamTP, and dGamTP; 

Lane 10, 11: reaction containing alldNamTPs.

结果表明 ，与KOD exo / A485L（泳道11）相反，未检测到由Therminator合成的单带产物（泳道10）。此外，检测了Therminator和KOD exo / A485L在没有某种或每种dNamTP的情况下进行PEX（泳道2-9）的保真度。尽管发现了一些错误的合并，但KOD exo / A485L比Therminator更有效地抑制了过多的扩展。在不存在dGamTP的情况下，KOD exo / A485L的主要产物（泳道5：+9nt）小于Therminator（泳道4：+ 10nt）的主要产物。此外，在没有每个嘧啶的情况下，KOD exo / A485L的延伸大部分通过第一次错误掺入而停止（泳道7（dCamTP）：+ 3nt，泳道9（dUamTP）：+ 6nt），但是Therminator产品显示出来自多种错误掺入的宽带（泳道6（dCamTP），泳道8（dUamTP））。该结果表明，与Therminator相比，KOD exo / A485L具有卓越的效率和保真度。

总结：同样位置的突变，在相似但不完全相同的两种酶之间，得到的结果差异很大，故可以选用与KOD DNApol相似的酶中已经已知的突变来对KOD DNApol进行突变的模拟，分析可能的结果，再进行突变。

A485L位于聚合酶的手指结构域，该残基可能不直接与进入的dNTP相互作用，但这种突变可能会影响构象转移，从而将进入的核苷酸传递到活性位点，进行合成。

文献出处：Bioorg Med Chem Lett. 2016 Jan 15;26(2):530-533. doi: 10.1016/j.bmcl.2015.11.079. Epub 2015 Nov 22.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26627581/