今年3月Cell推出了微生物组专刊，详见下方链接。

• Cell：22篇微生物文章为微生物组打Call

其中Peer Bork一篇关于人类肠道微生物组关联分析的综述写的非常系统，值得广大同行精读学习。

全文15000余字，我将阅读笔记分享给大家，欢迎广大同行留言讨论和批评指正。

人类肠道微生物组：从关联到调控

Thomas S.B. Schmidt,1 Jeroen Raes,2,3, and Peer Bork1,4,5

1. 德国，海德堡，EMBL结构与计算生物学实验室
2. 比利时，鲁汶，鲁汶大学微生物与免疫系
3. 比利时，鲁汶，VIB微生物中心
4. 德国，伯林，亥姆霍兹联合会
5. 德国，符兹堡大学，生物中心，生物信息系

我们对人类肠道微生物组的认识正快速积累，但这些知识的实际应用仍处于起步阶段。 这篇综述讨论了将微生物组研究转化为能够给人类宿主带来特定益处的靶向调控所必需的研究类型

人类微生物组是我们这个时代最具活力的研究领域之一，并且大部分研究工作都针对蕴藏着人体大部分微生物的肠道。在过去的十年里，由于技术的快速发展，我们对居住在肠道中的生物体、功能以及它们在人类健康和疾病中的作用的理解程度大大加深。肠道微生物组的研究发展正在经历着与其他生物系统类似的几个步骤：1. 零件清单(物种和功能组成)的编制；2. 系统或其组件与外部因素的关联；3. 功能知识的建立；4. 将这些功能知识转化推广为应用。对于肠道菌群的发展，这四步体现如下：

1. 十多年来，编制肠道微生物“零件清单”如火如荼，在原核生物领域以及属和种的水平上现在已基本完成。几项研究建立了微生物组结构和功能的基线 - 即物种及其基因列表 - 主要贡献来自MetaHIT(Li等，2014; Qin等，2010)和人类微生物组计划(HMP)(Nelson等，2010; 人类微生物组计划联盟，2012)的两项大型合作努力。 尽管新的多样性(特别是在亚种和菌株水平)仍在不断被发现，并且大部分微生物基因在功能描述上还不尽人意，但工业化人群中最主要谱系的普查正在接近完成(例如，Zhou等人，2018)。
2. 利用这些“零件清单”， 科学家们针对肠道菌群与疾病，宿主因素或更广泛的环境因素的关联进行了大量研究。 随着研究范围和覆盖度的增加，这些被统称为全宏基因组关联研究(MWAS)(Wang and Jia，2016)，类似于全基因组关联分析(GWAS)。 最近，MWAS已达到人口水平，因为大规模的横断面研究(Falony等，2016; Zhernakova等，2016)开始综合考虑各种宿主和环境因素对微生物组成的影响 (见专栏1)。
3. MWAS确定的关联是具有可观察性的，这种关联可能是间接的或者被隐含变量所混淆，而且不太容易转化为因果联系。但是，对于从功能上理解一个像肠道菌群这样的复杂系统而言，就必须将“零件列表”(类似于building blocks)(1维)连接成网络结构(2维度)在一个空间(3维)和时间(4维)的背景下(Raes和Bork，2008)，这个需要适应的概念(见下文)和方法学的技术手段(见专栏2)。虽然微生物组物种的互作网络(2D)研究，即物种之间的相互作用(1D)正在进行中，但根据横断面数据进行物种相互作用的统计推断仍然具有挑战性(Weiss等人，2016)。原因是目前的(粪便样本)测序结果的局限性，一、大部分是非定量的(Vandeputte等，2017c)，二、很难反映肠道的空间组织(3D)。此外，相互作用和微生物组的功能是动态变化的，尽管迄今为止的纵向研究(时间序列)仍然很少，但单个肠道微生物和整个菌群落在时间(4D)的背景下进行研究是必要的。无论从个体(agent-level)还是从整个系统层面(multi-agent system)，扰动实验尤其能够研究系统的动态(系统动力学特征)。越来越多的干预研究增进了我们对肠道微生物的功能了解，但观察到的反应是放之四海而皆准还是泾渭分明，或者因人而异则不是一语可以道破的(见专栏3)。
4. 最后，微生物组的理论价值逐渐被转化为实际应用，这意味着工作要从简单的扰动转到对微生物的调控。扰动可能引发微生物组的变化，但是其中大部分是不可预见的。靶向菌群调控，要做到尽可能的具有可预测的反应结果同时没有副作用，这需要从功能上对整个系统深入理解，但也需要一个公认的操作性定义，包括内在和与宿主相关期望的“健康”终点。

鉴于这些，我们预计微生物组调控在不久的将来将成为主要的转化投资方向，从而将建立的微生物组用于多种多样的治疗靶点。

在这篇综述中，我们将重点放在关联分析这个活跃的新兴领域(见图1)，特别是关于自然(非实验室条件in natura, not in vivo)人类肠道微生物组的研究，不太强调动物模型中体内实验的相关工作。 具体而言，我们重点关注了与微生物组成关联协变量的最近研究成果，讨论了MWAS的优势和局限性，为了解肠道菌群以及为改善健康和福祉而制定微生物组调控策略，强烈建议推动必不可少的纵向(时间序列)和扰动的实验。

图1. 靶向调控微生物组

图1. 靶向调控微生物组涉及三个连续和相互依赖的研究路线(宿主-环境-微生物组的互作三角)。目前微生物组的结构和功能组成已经初步建立，MWAS鉴定了众多影响微生物组成的协变量(Co-varying factors)。与此同时，纵向研究的开展为揭示微生物组内在动态提供重要线索。综上研究结果能为理解肠道菌群功能提供第一线索。扰动实验可进一步扩展认识，揭示微生物组系统的动态变化规律。最终整合对微生物组研究的理解，实现调控微生物组，造福人类。

与人类肠道微生物组成相关的协变量

由于微生物组内在和外在因素，肠道菌群的分类组成在个体之间千差万别(参见图2)。内因影响微生物组的状态，包括生命期成熟后的其自身反馈、通过物种相互作用。外因是指影响肠道微生物组或与肠道菌群相互作用的各种环境。这些可以解释一部分观察到的人口内部的变化，根据经验分为三个相互重叠的类别：宿主 - 外在因素(即在某种程度上影响宿主生活方式的因素，如饮食习惯)，宿主内在因素(如宿主遗传学)和环境因素(例如，母亲菌株对新生儿的垂直传播，或区域菌株库的新定殖限制;图2)。许多中小型MWAS已经将肠道微生物组成与这些因素联系起来(参见Lynch和Pedersen，2016; Wang和Jia，2016)。这些研究中的大多数已经探索了分类学组成的关联，通常为属或种水平，而功能组成(基因和功能库)受技术和经济成本的限制而受较少的关注。

此外，仅在最近才有足够大小的队列和全面的表型分析能够确定与广泛的协变量相关联并具有足够的统计功效(Falony等，2016; Goodrich等，2016; Turpin等，2016; Wang等，2016a; Zhernakova等，2016)。这种研究首次允许量化相关协变量对微生物组成的相对贡献。一个重要的发现是即使是最强的协变因素也只能解释个体间肠道微生物组变异的很小部分，估计综合效应的大小在10％-15％的范围内(见专栏1)。然而，这比技术变化要大得多(Costea et al., 2017b)，因此应该将已知的协变量考虑为MWAS的潜在混杂因素(见下文)。在这里，我们总结了先前关于人类肠道微生物组成的变异的研究结果，重点是最近的工作。

图2. 微生物组影响因素

图2. 影响微生物组组成的己知因素(协变量)

微生物组内在的因素，可按经验分为三类：宿主内因，宿主外因和环境。此外，微生物状态反馈也会影响组成。请明确这些分类是有重叠的，许多因素与其它存在关联。例如，饮食包含的微生物来自环境，可以肠道定殖，引起疾病状态，变成宿主内因，甚至用药。实践中区分是困难的，同时通常按不同的协变量分类(专栏3)。实际上，已知的协变量在人类肠道微生物组变异的效应是惊人的小(专栏1)。

专栏1. 为什么我们只能解释如此少的微生物组变异

失望的是，我们在技术和生物学层面上解释微生物组的变异仍然很低。在佛兰德肠道菌群项目(Flemish Gut Flora Project)和LifeLines-DEEP 队列的非冗余组成协变量(环境因素)解析率只有百分之几(Falony et al., 2016; Zhernakova et al., 2016), 同时宿主遗传因素的影响也只有相近的水平(Bonder et al., 2016; Turpin et al., 2016; Wang et al., 2016a) 甚至更低 (Rothschild et al., 2018), 与疾病的关联结果也同样如此 (Duvallet et al., 2017). 出现这种情况的原因可能是：
(1)    还有末知的协变量，或当前的测量还不准确；
(2)    个体组成比人群组成的变异更相关；
(3)    内在组成的稳定状态就是一个可变的范围；
(4)    真正的效果可能在更高的分类精度中发现 (Costea et al., 2017a)
(5)    中性和随机过程比之前预想的更强
(6)    肠道菌群内在的生态动态和互作、生态演替，生态系统成熟(G. Falony, S. Viera-Silva, and J.R., unpublished data) 是当前缺少纵向数据而仍末研究的因素

然而，当前量化的外部因子仅占微生物组变异的10%-15%，因此在临床中只有足够显著的效应因子可观察，一些因子在关联中很难发现。这有赖于MWAS研究进一步发展，考虑如宏转录组、宏代谢组的数据(Gilbert et al., 2016)。因此，合理的样本分类对于微生物组协变量的发现有很大改善，同时要加强纵向队列和干预数据的解读。

包括疾病和宿主年龄相关的微生物状态

微生物组成状态与微生物-外在因素相关，并受随机或生态因素影响(例如，环境中初次接触时的建立者效应)，但也可能是自我强化的过程。不同的微生物状态可能意味着与不同的外在因素相关，因此有必要对分析样本进行相应分型(见专栏3)。一种内在分型因素可能是肠型，但这些群落类型是受外部协变量，如饮食，时间迁移或炎症影响，还是代表了具有类似功能的内在不同因素的组合优化，或两者兼有还不清楚(Costea et al., 2018)。重要的是，微生物组的关联常常很复杂且很少是单向的：外部影响可能引发组成性变化，然后在适应的微生物组状态中变的稳定，但微生物组状态也以各种方式反馈给宿主，如通过产生某些代谢物。

一个例子是微生物组状态与来自各种医疗指征领域的疾病之间的复杂关联(Gilbert等，2016; Lynch和Pedersen，2016; Wang和Jia，2016)。在一些结直肠癌(Zeller等，2014)或关节炎(Scher等，2013; Tito等，2017; Zhang等，2015b)的情况下，单个标记分类群与疾病是相关的，但对整体组成的影响是轻微的(如低丰度菌)。相反，其他疾病状态与总体组成特征的变化显著相关，例如肥胖(Le Chatelier等，2013; Turnbaugh等，2009)或炎性肠病(IBD)(Manichanh，2006; Ott等，2004)等案例中，物种多样性或丰富度降低。然而，对于任何检测到的关联，先验经验并不清楚是微生物组导致疾病还是疾病导致菌群变化，或疾病状态和观察到的微生物组变化是由第三方因素引起。事实上，最近对28个MWAS数据集进行的一项荟萃分析(meta-analysis)发现，不同疾病之间微生物组存在共有的特征，意味着几个报道的疾病 - 菌群关联可能是非特异性的(Duvallet等，2017)，并可能与其他因素如时间迁移或炎症有关(另请参见Falony等，2016)。因此，需要建立验证所报道的微生物组标记的疾病特异性，并且最好进行事后检验(test post hoc), 例如，如果已知合并症或共有症状，正如结肠直肠癌和IBD的情况一样(Zeller等，2014)。

荟萃分析，又称“Meta 分析”，Meta意指较晚出现的更为综合的事物，而且通常用于命名一个新的相关的并对原始学科进行评论的学问，不但包括数据结合，而且包括结果的流行病学探索和评价，以原始研究的发现取代个体作为分析实体。荟萃分析产生的主要的理由是：对于多个单独进行的研究而言，许多观察组样本过小，难以产生任何明确的结论。

微生物状态下的其他已确定的差异遵循宿主年龄变化，最近由Kundu等人，2017; Lynch和Pedersen，2016综述。一些与年龄有关的转变是渐进的， 而另一些则是被年龄更清楚地界定(例如新生儿和年长的婴儿之间)，并且与生活方式改变相关(例如停止母乳喂养)。出生后，婴儿被存在于环境和母体的物种定殖(Tamburini等， 2016)。最近菌株水平分析证实了发育中的微生物组的大部分来源于母体，但定殖具有选择性，因为某些门的菌株是从环境中获得的(Korpela等，2018)。

新生儿和早期的微生物组成已经与几种儿童疾病相关，包括特应症和哮喘(例如，Fujimura等，2016; Stokholm等，2018)。有人认为，这可能是由于早期生活微生物组的紊乱，例如作为抗生素治疗的副作用(Langdon等，2016年综述)。其他早期生活事件，如出生模式(剖腹产与阴道分娩)或喂养(母乳喂养与配方奶粉)都与发育期或成人微生物组成有关(最近由Tamburini等，2016年综述)，但最近证据表明较长期的影响是混合的(Chu et al.，2017; Falony et al.，2016)。婴儿出生后多样性增加，同时微生物组成变化也是随着儿童晚期，青春期和成年后渐进式的(Kundu等，2017; Odamaki等，2016)。老年人表现出多样性丧失，时间组成稳定性降低和组成变化的特征，所有这些都与一般健康有关
还包括饮食和住房环境(生活方式受限制)等混杂因素(O’Toole和Jeffery，2015)或药物治疗(Ticinesi等，2017)。

宿主外在因素：药物、饮食、生活方式、BMI和粪便粘稠度

大量的研究测试了成人肠道微生物组与宿主外在因素(即至少在某种程度上受宿主生活方式的影响)的关联。例如，药物正在成为主要的协变量。无论是在眼前还是在更长的时间尺度上去看，口服用于减少病原体的广谱抗生素(副作用)会影响肠道菌群这已经是众所周知。也许更令人惊讶的是，越来越多的报告也将非抗生素药物与微生物组调节联系起来。例如，2型糖尿病药物二甲双胍已被证明比疾病本身对微生物组成的影响更强，这一效应最近在随机交叉研究( Randomized crossover study)中得到证实。同样，据报道，质子泵抑制剂，非典型抗精神病药和非甾体抗炎药等也会影响肠道微生物组。在佛兰德肠道菌群项目中，发现药物(包括抗生素，抗组胺和激素)是影响微生物组成的最重要协变量。在近期大规模体外筛查1,200种销售药物的研究中，发现大约一半的非细菌抗感染药和四分之一的人类靶向药物都抑制至少一种肠道中性菌，这意味着药物对肠道微生物组的影响仍然亟待被探索。

大多数药物都是化学复合物，但肠道微生物组经常面临数百万种饮食来源的复杂混合物。由于肠道共生中性菌对食物消化发挥的作用，饮食和微生物组之间的联系也被科学家们从不同分辨层面进行多年研究。这些包括广义营养类别的微生物组特征，例如素食或肉食的饮食，以及较长期的饮食模式。然而，虽然饮食 - 微生物组的关联在横断面研究中得到证实(Falony等，2016; Zeevi等，2015; Zhernakova等，2016)，但饮食因素在校正了协变量之后的分析中只解释了观察到微生物组变异的很小部分。这个范围可能代表了一个下限，因为大多数横断面研究都依赖于自述的饮食数据，这些数据有各种问题(Ioannidis，2013)。

一些生活方式因素如吸烟(Biedermann等，2013)，喝酒(Dubinkina等，2017)和体育锻炼(Barton等，2017; Clarke等，2014; Petersenet al，2017)与微生物组成成分有关，但不在最近的人口研究中排名协变量的Top-N中。微生物组与体重指数(BMI)和肥胖的相关性已受到相当大的关注，据报导它们之间的关系基本呈现出物种(Turnbaugh et al., 2009)和功能(Le Chatelier等，2013)多样性的负相关。最这一发现被扩展到亚种水平(Costea等，2017a)。根据最近的元分析，FGFP中发现了一个统计上显著但差别不大的BMI-微生物组关联(Falony et al., 2016, 2014; Sze and Schloss，2016; Walters等，2014)。

按照布里斯托尔粪便量表评估的粪便粘稠度是FGFP研究中整体影响最大的因素，占观察到的微生物组成变异的5％(Falony等，2016)。最先在一个小规模队列中进行量化(Vandeputte et al., 2016)，这一因素最近又在另一个独立队列中得到证实(Tigchelaar等，2016; Vandeputte等，2017c; Zhernakova等，2016)，研究显示其和喝水行为无关(Vandeputte et al., 2017a)，但受食物消化转运时间影响(Roager et al., 2016)。

显然，许多这些宿主-外在因素不是彼此独立的(例如，饮食和粪便转运时间，BMI和用药)，并且可能与宿主固有或环境因素有关。因此，需要注意许多观察到的微生物组成特征可能是由混合效应驱动的。

内在宿主因素，如遗传

上述因素(如BMI)可以部分归因于遗传。对于另外的一些因素，宿主遗传因素更为明显：例如，微生物组与先天和适应性免疫系统错综复杂的相互联系(Belkaid and Hand，2014; Hooper等，2012); 尽管单独量化免疫系统在形成肠道微生物组中的影响仍然具有挑战性。 类似地，越来越多的证据表明脑-肠(微生物)轴的交互作用(例如，Carabotti等，2015)。 同时，几项研究探讨了微生物组与单个宿主基因位点更直接的关联(Hall et al., 2017; Kurilshikov et al., 2017)。 在对英国双胞胎的大型横断面研究中，发现几个属的相对丰度是可遗传的(Goodrich等，2016, 2014); 这个观察结果后来在物种水平上得到了证实，并扩展到了一个较小亚群的功能基因含量(Xie et al，2016)。一项对1,561名北美人的研究同样报道了种群的遗传性，以及6个人类SNPs与菌群丰度的关联(Turpin等，2016)，其中9个基因座与微生物分类群相关，33个与微生物代谢通路相关，同时也在荷兰LL-DEEP研究队列有相似报道(Bonder等，2016)。对大型北德队列研究报道，42个SNPs占观察到的微生物组成变异的10％(Wang et al., 2016a)。相反，最近对以上数据集的再分析(由696个以色列个体进行的扩展)估计宿主遗传学占微生物组变异的不到2％(Rothschild等，2018)。总体而言，宿主遗传因素对肠道菌群的影响是显著的，但效应量极小。与受试者性别相关的潜在差异(在FGFP和LL-DEEP研究中报道的最高级别的协变量中)可能是由于间接影响，例如受文化行为，饮食或不能精确到基因组的蛋白质差异激素水平的影响。

环境因素

尽管人们已经报道了群落构成中的地理模式，可能与生活方式有关(例如Suzuki和Worobey，2014; Yatsunenko等，2012)，但迄今为止人类宿主无法控制的环境因素仍未得到充分研究。当将生物分类学精度(分辨率)扩展到亚种、菌株或松散可操作分类定义时(如OTU/ESV)，更加明确的地理格局变得明显(Costea等，2017a; Truong等，2017)，这意味着不同区域菌株库可能有不同的功能。事实上，这可以进一步细化到家庭和家人的水平，在成年期可以发生肠道菌株的替代(Korpela等，2018)，这可能是同一家庭成员显示出比不同家庭人员更类似的微生物组成的原因之一(Song等人，2013)。研究在更广泛的人造环境(Hoisington等，2015; Lax等，2014)以及与自然密切接触的家庭(Obregon-Tito等，2015)可能会揭示影响个体肠道微生物组的其他环境因素。

研究微生物组关联的局限性

队列大小的增加，研究设计的改进以及全面的元数据调查极大地提高了MWAS的统计效能(statistical power)。然而，它们无法克服关联研究的固有局限性，这些局限性被原始数据的复杂性和变异所放大，并且需要在解释和比较MWAS的结果时考虑。

实验技术引入的变异

像其他组学研究领域一样，MWAS容易受到同一研究内和不同研究间批次效应影响。最近两项关于微生物 - 疾病关联研究的荟萃分析发现，不同研究之间的变异需要直接地或间接地校正批次效应(Duvallet等，2017; Pasolli等，2016)。典型的微生物组学研究中几乎在每一步，包括样本采集和储存(Hang et al., 2014; Song et al., 2016; Vandeputte et al., 2017d; Voigt et al., 2015)，DNA提取和处理(Costea 2017b; Sinha等，2017)和生物信息学分析(Mallick等，2017)都是确定的存在技术变异。事实上，最近关于技术限制可重复性的两项大规模研究表明不同工作流程之间，以及同一工作流程在相同或不同实验室中的重复之间存在较大差异(Costea et al，2017b; Sinha et al，2017 )。至少与标准流程相比(Costea等，2017b)，这需要一个完善细化的参考标准方法。

特异性和间接关联

即使可以减少技术变异，一般来说关联性研究也有一些共同的局限性。首先，在这样的研究中不能证明任何一个关联的特异性。譬如，发现疾病关联不一定意味着观察到的差异在不需要一个独立重复并与其他表型比较的前提下就可以用作特定标记。其次，任何关联都可能是间接的。一个恰当的例子是之前反复被报道的微生物组与艾滋病毒的关联最近受到质疑，因为大部分观察到的信号来自一个风险群体，男同性恋(Noguera-Julian等，2016)。即使这种更直接的联系也可能被未经验证的因素混淆，例如性行为，社会地位或生活方式。同样，混淆因素可能导致质疑几个以前报道的疾病相关性。例如，使用药物二甲双胍引起了早期关于与2型糖尿病有密切关系的微生物组的报道(Forslund等，2015)。一项综合调查表明，以前报道的各种关联至少部分是与次要因素混淆相关的(Falony et al., 2016)。

分类精度和功能描述缺乏

迄今为止，大多数MWAS都依赖于16S rRNA基因的扩增子测序。这种方法相对成本较低，使得大尺度的队列研究成为可能。然而，目前16S扩增子测序可靠的分类学级别通常仅限于属种水平(Matias Rodrigues等，2017)，最近的一些分析表明许多分类学关联可能在种水平以下(亚种或菌株)出现(例如Costea et al。2017a; Lloyd-Price等，2017)。而且，扩增子方法经常将分类范围限制为细菌和古细菌，从而缺失肠道菌群的真核和病毒成员的潜在信息。随着全基因组鸟枪法宏基因组测序变得更加经济可行，这些分类学分辨率和范围的限制很快就可以克服(见专栏2)。宏基因组测序也提供了微生物组基因和功能库组成，但是这些有价值的信息通常还没有深入研究，部分原因是缺乏功能注释：更主要是来自可培养的分离菌和宏基因组的微生物基因至今尚不清楚。

专栏2. 推动微生物组学研究的方法

微生物组作为一个研究领域，是由技术带动发展起来的 (Mallick et al., 2017综述)。这里我总结最近发展的，以及在不远将来可实现且有意义的技术，使我们解决新问题，并推动从观察向干预研究的转变。

多组学

扩增子和宏基因组测序在近十年里极大的推动了微生物组研究，而且将继续主宰这一领域。最近宏基因组物种和功能的研究正在增长，同时补充有宏转录组、宏蛋白组和宏代谢组研究(详见Franzosa et al., 2015; Mallick et al., 2017的综述)。代谢组分析常被作为独立的证据来验证MWASs(微生物组关联分析)的假设，例如建立微生物代谢物与心血管疾病(Wang et al., 2011)、肠道菌群代谢与胰岛素敏感(Pedersen et al., 2016)。

宏转录组提供微生物基因表达更直接的结果，采用这一结果作为微生物功能潜能会提供新的研究视角。而肠道蛋白组虽然有零星的研究，但缺少大规模的分析。

我们面临多组学分析的挑战：不同层面的数据提供混合层面的证据需要说明互相的关系，整合分析将挑战之前的微生物组概念，如功能可塑性的相对重要性。

绝对定量微生物组特征组成(QMP)

绝大多数微生物组研究依赖组成型数据——物种和基因的相对丰度并使用无信息的文库总量标准化，组成效应可能引起物种-物种，物种-协变量间关联的假阳性。使用标准内参(spiked-in)、己知的细胞数量和流式细胞计数等方法可以获得微生物的绝对定量。事实上，不同个体微生物承载量(microbial load)差异很大，并与群体结构相关，如在克罗恩病中微生物承载量下降。QPM可以在MWASs分析中增加敏感性和特异性。

体外微生物组和微流控

体外方法用于微生物组经典还原法的建立正经历高通量、探索分析的复兴。几个微生物组微流控的肠道芯片为研究肠内环境提供了平台。与此同时，高通量培养可实现在预定义的培养基上实现复杂营养型和厌氧生物的培养。

由于细菌是肠道微生物主体且大多数可培养，因此目前的研究主要集中的细菌上。真核、古菌、病毒成员有一些研究，且当前进一步受到重视。同时多亏了大家测序菌株的努力，古细菌、细菌的参考基因组正在增加。此领域的动态：10年前人类肠道宏基因组中大多数序列无法分类，到2013年时有近一半存在参考序列；估计再过几年，空白会越来越少，我们起码知道其中原核组成的主要种类。

微生物组研究不仅增长了物种的覆盖度，同时增加了精度。自2013第一个单核苷酸变异(SNVs)的微生物图谱发表，众多微生物SNVs、亚种和株水平鉴定工具己成功研发并应用于人类肠道微生物组。最近几个种水平观察微生物组的研究已经深入到株水平。在亚种水平的关联分析与协变量关系更明显。这表明物种分类精度增加将有助于揭示之前没有发现的微生物组的关联。

相关不等于因果

相关性并不意味着因果关系这在微生物组研究中已经成为科学的真理：虽然因果方向性对于某些关联而言微不足道(例如，抗生素治疗影响菌群，而不是相反)，但是仅基于观测数据难以或不可能推断其他。已经成功应用于其他领域的因果推断的几种数学方法开始被用于微生物组数据，如结构方程模型或贝叶斯网络推断。然而，由于数据规模和复杂性的限制，普适性难以得到推广，许多推断框架需要重复(纵向，时间序列)观察(见下文)。评估个体关联因果关系的金标准是经典的还原法，通常依赖于小鼠模型。例如，最近在小鼠结肠炎模型中发现了免疫梭状芽孢杆菌的潜在保护作用，该模型使用称为微生物表型三角测量的框架(Surana和Kasper，2017)，满足Koch假设的“共生”版本(Neville等人., 2017)。然而，这样的工作流程需要成功地分离和培育目标菌群，这在实践中仍然具有挑战性。在某些情况下，MWAS研究结果通过将人类粪便菌群移植到小鼠模型中进行了实验验证(Wang和Jia，2016年综述)。然而，尽管无菌鼠模型的实验条件可控，但也受到若干限制，包括人和鼠消化道之间的解剖和生理学差异，由于吃粪便造成的同笼效应，基本上不同的微生物组成差异物种间重叠很少，宿主免疫压力不同影响微生物的p定殖(Hugenholtz和de Vos，2018; Nguyen等，2015)。因此，将体外或体内研究结果转到人类领域仍然困难。

通过纵向研究了解微生物组动态变化

尽管讨论了一些注意事项，MWAS已经确定了重要的微生物 - 疾病关联，这些关联可以用于目标疾病诊断，并揭示肠道微生物组成的主要协变量。然而，大多数研究是横断面类型，因此对调控机制的理解仍然有限。大规模的纵向数据产生，包括(1)无扰动肠道微生物组的基线动力学和(2)对各种扰动的响应(见下一节)，对于理解肠道生态系统的“布线(wiring)”刺激和反应的解决可以帮助解开自然界中(即直接在人体宿主中)微生物组群的因果方向性。许多研究已经得出结论，在干预的情况下，肠道微生物组物种和功能组成在基线时随时间显著稳定。例如，随着时间的推移，个体内属和种水平的组成变化低于个体间差异(参见例如Faith等，2013;人类微生物组计划联盟，2012等)已经扩展到株水平分辨率(Costea等，2017a; Lloyd-Price等，2017; Schloissnig等，2013)。最近，据报道，粪便微生物组也随着时间推移在转录组学上稳定，尽管稳定程度较低(Abu-Ali等人，2018)。与成人未受干扰的菌群的这种一般时间稳定性相反，已经描述了发育中婴儿菌群清晰的演替动态(Ba¨ckhed等，2015; Koenig等，2011; La Rosa等，2014) ，而老年人可能会显示微生物组稳定性明显下降，这也取决于进一步生活方式因素的影响(Jeffery et al., 2016)。总之，人类肠道菌群的时间变化尚未得到充分研究，目前发表的大多数研究无论在个体数量，时间点数量还是时间分辨率方面都存在统计上的不足。具有足够队列大小的高分辨率研究对于建立肠道微生物组动力学的预测模型是必不可少的，然后可以对模型扰动响应进行优化和改进(Bucci和Xavier，2014; Faust等，2015)。这不是一项简单的任务：即使相对明确的新生儿群落演替已被证明很难建模预测，可能是由于母体和环境贡献菌株的相对重要性变化有关(Asnicar等，2017; Korpela等，2018年)。

通过扰动消除菌群的“布线”

扰动实验长期以来一直是系统生物学(Jansen，2003)和群落生态学(Bender等，1984)所选择的研究框架，因为群落层面对扰动的反应可以推断关于其成员之间的互动。尽管经典生态学理论对微生物组的盲目应用并非没有风险(Koskella等，2017)，但微生物生态学的微扰动实验的价值已经被反复证明(Faust等，2015; Shade等)，事实上，微扰动实验对于菌群落动态预测模型的发展比横断面研究信息更丰富，特别是当补充体外和体内实验数据时(见专栏2)。这种扰动预测典范可以提供可测试的假设，并且对于肠道菌群的靶向调节是必不可少的，而肠道菌群又是解释工作的核心(参见下一节)。在这里，我们回顾介绍性研究如何促进我们对肠道微生物组的理解和突出新兴趋势。我们使用广义的扰动定义，包括药物治疗或饮食干预等刺激。

扰动响应作为菌群落结构和动力学的窗口

尽管纵向分析对于了解基线微生物组动态是必不可少的，但微生物系统的扰动可以更深入地了解其生态构成(Faust et al., 2015; Shade et al., 2012; Sommer等，2017)。可以说，对人类肠道微生物组的持续时间最长的扰动实验是饮食摄入量，因为这种自然过程已经发展了数百万年。在采取更久坐的生活方式之后，人们已经适应了多种多样的杂食性饮食，因此适度饮食转变的影响应该是有限且短暂的。事实上，一些研究表明饮食干预通常似乎只能引起特定的效应(参见Zmora等人2016年最近的综述)，尽管更极端的变化可以显示更明显的特征。例如，基于微生物组的全植物或动物的饮食的根本转换具有不同的影响，并且特定群体的类群对于个体的响应类似(David等人，2014)。另一项研究发现，在肥胖患者中对能量限制性高蛋白饮食的反应，基因丰富度在整个生态系统范围内均有增加(Cotillard et al., 2013)。一般来说，迄今为止大多数研究都调查了相当广泛的饮食结构变化，例如，蛋白质或碳水化合物等非特定营养素类别的总体变化水平，但定义的特定饮食干预措施的影响才刚刚开始探索。与饮食转变相反，临床干预可望引发更激烈的反应，因为它们可以显著改变肠道中的环境条件。清洁肠道通常是在制备其他治疗方法时进行的，然后可以快速恢复整个微生物组成(Voigt et al., 2015)，尽管它可能会引发单个分类群的持续损失(Jalanka等，2015)。其他对微生物组长期影响的临床干预措施包括减肥手术(Tremaroli等，2015)或诱导的等渗(iso-osmotic)腹泻。后者报道会引起显著但短暂的影响，扰动恢复后各类别间一致的演变(福山等人，2017)。广谱抗生素治疗可能具有显著的、持续的，并且通常是非特异性的影响，由于群落中的分类群的丢失，有时扰动后无法完全恢复(Dethlefsen和Relman，2011; Dethlefsen et al，2008; Jakobsson等，2010; Jernberg等，2007; Voigt等，2015)。同样，用窄谱抗生素头孢丙烯治疗引起个体分类群的一致反应，而群落层面的反应则是分型的(Raymond等，2016)。

必须注意的是，大多数可控的干预研究集中于微生物组在宿主对微扰动的响应，而不是微生物组的响应本身。宿主和菌群的效应难以解释清楚：例如，抗生素治疗明显影响菌群(这可能会间接影响宿主)，独立宿主和微生物组对饮食干预的反应更难以区分。因此，尽管存在其它限制(Nguyen等，2015)，许多扰动研究已经允许在一定程度上控制宿主效应的小鼠模型中进行。此外，体外方法正在得到重视(见专栏2)，因为这些方法可以非常直接地探测群落或个体菌株对特定扰动的反应，而与宿主无关(Maier和Typas，2017年)。体外筛选是可扩展的，并且可以下降至各个菌株中单个基因的分辨率(Galardini等，2017)，同时允许非常广泛的设计，最近的实例是筛选了1200种筛选的药物抵御40种肠道微生物菌株(Maier等，2018)。因此，如最近关于盐对微生物组影响的研究表明，体外筛选可以作为大规模假设生成器来指导体内微生物组扰动响应的研究，无论是在动物模型中还是直接在人类中(Wilck et al，2017)。尽管如此，还需要对人类进行系统扰动研究，其唯一目的是理解肠道微生物的微生物生态。元数据采集变得越来越全面和复杂，数据生成变得更加经济实惠，越来越多地采用更大和更可控的前瞻性和介入性研究设计。这将使我们能够探索微生物组之间的分类学和功能相互作用，并理解微扰动响应的基础。鉴于人类 - 菌群共生的复杂性，只有“现实生活”数据才能为建立真实的预测模型提供必要的信息。

从扰动到预测

到目前为止，扰动响应的预测建模已被证明是非常具有挑战性的(Bucci和Xavier，2014; Faust等，2015)，既是因为复杂性和变异性，也是因为我们对于肠道微生物组认识非常有限(参见上文)。此外，有人认为，微生物组对许多扰动的反应本质上是随机的(Zaneveld等，2017)，因此不能完全预测。

然而，存在一些单个分类群或分类群级别的微生物组动态预测模型(Bucci and Xavier，2014)。例如，Lotka-Volterra模型用于预测小鼠对艰难梭菌感染反应的群落动态(Stein et al., 2013)。所得模型随后可预测艰难梭菌保护性益生菌治疗是否成功(Buffie等，2015)。此外，使用针对微生物组成和非微生物组特征培养的复杂模型，可以在一定程度上预测个性化饮食干预对选定微生物组特征的影响(Shoaie等，2015; Zeevi等，2015)。尽管取得了这些进展，但更高层次的扰动响应往往难以预测，例如分类和功能多样性的获得或丧失，或组成变化的整体强度(更不用说方向)。对于微生物组的恢复力也是如此 - 一个扰动系统恢复到扰动前状态的程度(Shade et al., 2012)。正如上面所讨论的，有研究表明微生物组通常对更小的扰动有弹性，但更明显的扰动可能具有持续的影响。有人认为，即使菌群复原力的基本因素和机制仍然知之甚少，尽管个体之间的差异适应能力可能是健康和疾病的指示(Lloyd-Price等，2016; Sommer等，2017)，但预测某个菌群会如何抵御扰动仍然具有挑战性。

从扰动到调节

肠道菌群的经验性治疗调节已经进行了数千年，例如使用传统草药(Xu等，2015)或有意识地通过粪便菌群移植(de Groot等， 2017年)。尽管过去十年有大量报道，肠道菌群与疾病之间的联系仍在不断被发现(Lynch和Pedersen，2016)，因此人类肠道菌群作为治疗靶点受到关注(Langdon et al.,  2016; Walsh等，2014)。

在这里，我们回顾了最近在非靶向和靶向微生物组调节方面的尝试。本文我们广泛地将定义调节为一种干预手段，目的是将肠道菌群推向期望的状态。其中包括粪便菌群移植，益生菌和益生元治疗以及定向饮食干预。

粪菌移植(FMT)

FMT是非靶向微生物组调节的主要例子：来自健康供体的粪便转移到受体的胃肠道中，目的是改善其健康或不希望的微生物状态。已证明FMT在复发性艰难梭菌感染(RCDI)的治疗中非常有效，并且确实似乎比抗生素更适合于该疾病(van Nood等，2013)。尽管在其他领域，如溃疡性结肠炎(Narula等，2017)或代谢综合征(Vrieze等，2012)成功率较低，FMT作为众多适应症治疗的备选方案正在进行中，目前有200个注册临床试验(clinicaltrials.gov，截止2018年1月)。一个明显的长期目标是采用定制的微生物菌株配制，接受者采用定制的混合物替换目前使用成份不明确的供体粪便样品。

FMT常常在临床实践中，先进行准备性抗生素治疗或肠道清洁，效果可能难以解释清楚。一些研究调查了FMT的微生物组水平效应，并报告说治疗后接受者的微生物组中的α多样性增加，并且RCDI患者群体结构向供体组成的转变(Fuentes等，2014; Seekatz等2014)，IBD也观察到了这一趋势(Vermeire et al., 2016)。相反，FMT之后的群落组成在代谢综合征(Kootte等，2017)和溃疡性结肠炎试验(Fuentes等，2017)中与FMT前组成有微弱相关，呼吁进一步提高分类学精度。事实上，在菌株种群水平上，可以证明供体菌株的植入，尽管在移植前相同物种的菌株存在于接受者体内，成功的定殖更可能(Li等，2016)。此外，发现供体和受体菌株在接受者中FMT后至少几个月的时间内共存(Li等，2016)，这一发现已经在不同适应症的独立队列中证实(Kumar等2017; Lee等，2017; Moss等，2017)。虽然这对未来适应性治疗方案是令人鼓舞的，但我们对菌群和FMT的反应的机理理解仍然不足。事实上，从微生物生态学的角度来看，FMTs提供了一个独特的环境来研究菌群落的抗性，演替和整体适应能力。

益生菌

益生菌，被定义为“活的微生物，当给予足够量的活性微生物时可以给宿主带来健康益处”(Hill等，2014)，已被证明在某些适应症中是临床有效的治疗选择(Ford et al，2014年)。与FMT相反，益生菌治疗是对肠道菌群进行有针对性调节的尝试，特别是通过向群落添加益生菌。然而，益生菌治疗的微生物组影响可能是轻微的：最近对七项随机临床试验进行的系统回顾发现，不同益生菌对菌群组成的影响并没有持续益生菌定殖的证据(Kristensen等，2016)。这重申了肠道微生物菌群定植抗性的概念，包括益生菌和病原体。相比之下，小鼠研究已经得出结论，移植成功可能取决于益生菌如何与受体的基线微生物组分互补。例如，发现Clostridium scindens治疗中使用代谢补充接受者的菌群并增强对艰难梭菌的定植抗性(Buffie等，2015)。该结果基于临床数据，小鼠模型和数学建模，并说明生态学启发式方法可以实现成功的微生物组调节。因此，下一代益生菌的未来不仅在于补充有益的功能，而且在于提供必要的生态环境来维持它们。此外，通过补充更复杂的生物体混合物，整个微生物组成整体的转变很快就可以实现。

益生元和膳食干预

益生元被定义为’具有健康益处的宿主微生物选择性利用的底物’(Gibson等，2017)，是另一种有针对性的微生物组调节手段。与直接施用益生菌相反，益生元治疗旨在赋予微生物有益成员选择性优势。尽管一些研究表明益生元对不同适应症具有治疗潜力(Beserra等，2015; Ford等，2014)，但对于其对整个微生物组成的影响却知之甚少。有报道称普氏菌Prevotella / 拟杆菌 Bacteroides比例增加和葡萄糖代谢改善是随着向纤维丰富的饮食而短暂转变(Kovatcheva-Datchary等，2015)。同样，富含纤维的饮食，辅以其他益生元，使肥胖儿童的肠道微生物组功能组成发生改变，并导致体重减轻(Zhang et al., 2015a)。据报道菊粉型果聚糖的处理引发双歧杆菌和厌氧菌的增加，几乎没有任何群落水平的影响(Vandeputte等，2017b)。

除了通常定义的益生元的补充之外，饮食代表大量的化学和生物分子化合物，通常潜在改善微生物，是形成微生物组成的重要因素(由Flint等，2017评论)。因此，定向饮食干预不仅可以提供扰动实验的信息，而且还可以作为温和的微生物组介导的治疗方案进行探索(Suez和Elinav，2017)。微生物全范围代谢模型已被用于成功预测肥胖和超重个体饮食干预的微生物组代谢反应，通过基线微生物基因丰富性分层(Shoaie等，2015)。同样，在使用微生物组，临床和饮食数据训练复杂模型时，针对改善的血糖反应的个性化饮食干预措施在盲法随机试验中被提出和验证(Zeevi等，2015)。虽然这两项研究都针对宿主效应进行了优化，但作者在一定程度上也能够预测微生物组对干预的反应。重要的是，这两项研究都发现菌群可以将干预效应分层，并且对饮食的反应可能是真正独立的(见专栏3)。此外，还有待确定的是对干预的这些个体间差异有多少可以归因于菌群的内在因素或宿主因素(见图2)。

专栏3. 微生物组分型和个性化宿主对扰动的响应

最近越来越明确的是不同个体的微生物组变异与不同扰动响应有关。人类肠道微生物组可分为明显不同的组成类型，即肠型，详见Nature综述：肠道菌群如何划分肠型。最早的研究表明肠型随时间稳定，即使是短期的饮食干预。肠型与肠道内一些微生物组存在联系，对药物遗传学和药物代谢物有关。例如，普氏菌与拟杆菌比例可预测饮食干预依赖的糖代谢改善；肠道可预测抗生素头孢丙烯治疗时的反应，进一步增加了肠型对扰动不同响应的结论。

一些研究报导了通过特异的微生物组对不同药物响应进行分型。例如在一些病人里，迟缓埃格特菌可代谢心脏药物地高辛，导致药物失效。在黑色素瘤病人进行抗PD1和抗CTLA4化疗中，其效应也依赖于肠道菌群，即不同反应人群的肠道菌群不同。相似的最近研究报导，线虫肠道菌群在代谢氟嘧啶化疗药的不同反应。

微生物组通常认为是参与调节宿主对饮食干预的响应，但在一些情况下个体的复杂情况是不可预期的。有报导复杂模型(包括生活方式、血液属性和菌群组成)可预测饮食干预，并在随机对照样本中验证。相似地，微生物广泛的代谢模型可成功预测饮食干预的不同效应，如分型预测个体干预后响应和作为实践中考虑的指标之一。

针对肠道菌群的靶向和可预测调节

在小鼠模型中最近几项研究已经证明靶向微生物组调节的潜力。例如，发现生孢梭菌将芳香族氨基酸代谢成几种在宿主血清中积累的化合物，并且在无菌小鼠中用遗传工程菌株替代野生型生孢梭菌，降低了这些代谢物的血清水平并且影响了肠道通透性和宿主免疫应答(Dodd等，2017)。最近报道，钨酸盐处理选择性地抑制某些肠杆菌科的过度生长并改善了鼠结肠炎模型中的症状(Zhu等人，2018)。作者之前发现，在小鼠诱导性结肠炎期间，隐含在肠杆菌科花中的钼依赖性酶(被钨抑制)(Hughes等，2017)，并且这种生态学和功能性见解使得肠道微生物组调节成功。

这些研究重申了这样一种观点，即有针对性的、假设驱动的调节需要理解菌群的分类学和功能组成，相互作用结构以及相关的生态动力学。由于这种功能性理解才刚刚开始出现，目前的模型对预测微生物组调节结果的能力有限，对于许多临床有效的干预措施，尚不清楚微生物如何介导宿主水平的影响。有许多宏观生态的例子表明人类干预对未完全理解的生态系统产生意想不到的灾难性影响。例如，澳大利亚的侵入性毒蟾蜍(Bufo marinus)20世纪30年代作为防治有害生物而引入，后来发展成为当地生态系统的主要负担(Phillips and Shine，2004)。类似地，微生物组调控干预已报道存在罕见的不良反应，最显著的是FMT(Wang et al., 2016b)，并且对这些干扰的微生物组相关原因了解甚少。大多数研究报导调控微生物组水平效应的研究在属或物种水平上都是如此。然而，对于几种益生菌，只有特定菌株被发现具有临床有效性(Kristensen等，2016)，并且给定菌株的功效可能取决于受体的菌群。事实上，一些大肠杆菌菌株是高度有益的益生菌(Wassenaar，2016)，而另一些菌株则是有害的病原体(Kaper等，2004)。这说明了适当的分类学解决方案对于成功调控菌群的重要性(见图3)：精确干预需要对目标系统进行精确理解。

在一个健康的个体中定义健康的菌群

由于迄今为止对菌群的“健康”达成了共识，所以目标终点的定义仍然是微生物组调控的核心挑战，(见Lloyd-Price等人，2016年最近的综述)。最近，提出了一种微生物组“全球定位系统”，根据多元读数区分健康和患病状态(Gilbert et al., 2016)。然而，虽然一些疾病状态可能与特定的微生物组特征相关，但跨群组明确“健康”的微生物组状态尚未建立(Lloyd-Price等，2016)。其他人则提出了明确的时间分辨的微生物组健康定义，例如关于独特的时间变异性特征模式来区分健康和患病状态(Marti’等，2017)。同样，有人提出，微生物组的健康体现在对扰动的反应中，并且“安娜卡列尼娜”原则适用于菌群 - 在托尔斯泰的变种中，“健康的菌群都是相似的;每一种不健康的微生物都是以自己的方式不健康“(Zaneveld等，2017)。此外，人们一再表示健康的标志不是对扰动的响应能力，而是扰动后的恢复能力(Sommer等，2017)。

当然，任何定义的健康微生物组都是于其参考框架决定的。从临床角度看，健康是由人类宿主观点决定的 - 任何与健康宿主状态有关的微生物可能被认为是“健康的”。“但是这种以宿主为中心的定义可能是不完善且存在争议的。综上所述，宿主和微生物组之间的联系是多变的和复杂的，因此宿主的许多疾病不一定携带明确和特定的微生物标记，即使对于良好描述的关联研究因果性的方向通常也不清楚。疾病相关的微生物组失衡很难界定，明确健康相关的微生物组状态也是更具挑战性的。虽然微生物组和宿主健康是明显联系的，但多个健康的菌群状态可能存在于健康的宿主内。

图3. 前肠道菌群研究的合适方法

图3. 微生物组前沿迅速发展，当前肠道菌群研究不同角度的合适方法。
此处对研究路线进行描述和分析，具体随着科学问题、研究设计不同而变化。
(A)    虽然在一些关联分析中有更高的精度，16S rRNA基因扩增子数据通常确定微生物属水平组成。最近可提高到株水平精度，是微生物学科学家喜欢的研究精度。
(B)    虽然单个基因有时有意义，但功能关联通常决定整个功能类别，或详细的功能单元。
(C)    在一定的队列中微生物组群体结构与宿主基因存在关联，但进一步的人分层来清晰信号是必要的。一些例子，在个体水平存在特异关联。
(D)    为方便实验，简单系统允许更高的通量，但与自然微生物组差别更大，例如每个人是独立的环境。

结论和展望

我们对人类肠道菌群的了解持续且快速发展。微生物组的普查 - 建立其“零件清单” - 对于主要的原核生物谱系来说已经接近完成，尽管在亚种和菌株水平上仍然发现了惊人数量的新多样性，这意味着鉴定肠道中的新基因正在进行中。虽然原核细胞谱系丰富地提供了肠道微生物组的绝大多数，但是由于真核和病毒菌群仍未完整绘制，重要的参与者仍可能会被遗漏。宏基因组关联研究已经确定了微生物组成的主要驱动因素，并将个体微生物分类群和基因与疾病，宿主生活方式和生理学联系起来。然而，他们还发现，已知因素只能解释总微生物组变异的很小的一部分，至少没有微生物组状态的分层。纵向研究已经开始为肠道菌群的时间动态建立基线，并发现它随时间变得非常稳定。扰动实验进一步推进了我们对微生物组的功能理解，包括其内在的相互作用结构 - 其各部分的“布线” - 以及与外部因素的因果关系。此外，越来越清楚的是微生物组分层可能使宿主开展个性化的菌群干预化。

微生物组越来越多的功能性理解开始转化为实践，以调控目标微生物。大多数体内微生物组调节的尝试都具有治疗意图：研究人员旨在通过替代微生物组来改善患者的健康状况。然而，实际上关于期望的微生物研究终点 - 关于什么是“健康”的微生物- 尚未出现共识。

目前，理解滞后于应用：为什么像FMT这样的非目标干预在某些情况下有效但在其他情况下效果不明显，要清醒的认识到精确的微生物组调节仍处于初期阶段。主张通过更新的方法学工具包(包括多组学技术和新的体外方法)来推动更多和更大规模的纵向和干预研究，更少关注宿主，而多关注微生物本身。 这些研究将进一步推进我们对微生物组的理解，有能力阐明缺失的环节，并使我们能够更好地预测对干预措施的响应。 因此，扰动的综合研究将使我们能够真正推进人类肠道菌群的研究，从关联到调控。

引文

1. Schmidt, T. S. B., J. Raes and P. Bork (2018). “The Human Gut Microbiome: From Association to Modulation.” Cell 172(6): 1198-1215.
2. PMID: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29522742
3. sciencedirect: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867418302216?via%3Dihub

翻译：Tank

校对排版：刘永鑫

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