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之前本平台分享过STAMP的使用：

• 微生物组间差异分析神器-STAMP  

今天带来了更详细、深入的讲解和高级玩法。

简介

软件简介

STAMP是一款用于分析微生物分类和功能谱的软件，不仅可以做统计，更能绘制多种图形，方便发表使用。

1.0于2010年发表于Bioinformatics，被引493次；2.0于2014年1月发表于Bioinformatics，引用483次(截止2018年5月26日)。

官网地址：http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP

最新版本2.1.3，Downloads部分可以下载适合自己系统：如Windows/Linux/MacOS版本的软件。本文内容主要翻译自STAMP用户手册v2，2014年12月15日版本 http://kiwi.cs.dal.ca/Software/images/c/cd/STAMP_Users_Guide.zip ，读者添加了自己的理解，以及按读者自己的学习逻辑重排。一些章节标注了原文页码，如P4代表原文第4页。

安装目录中Examples目录提供了示示例分析结果，以及演示数据实例。

STAMP能干什么

STAMP可以现实不同平台下兼容性分析数据，主要包括Beta多样性散点图、物种丰度柱状图、箱线图，以及Post-hoc图展示差异物种/功能。

还可以绘制带误差线柱状图、误差线和柱分离组合图、相关散点图、密度柱状图、P值柱状图等统计图表。

分析实战

输入文件

本质上是文本的OTU表或功能组成矩阵 + 实验设计即可。同时也支持biom格式。MG—RAST、IMG/M、CoMet、RITA等软件的结果。

OTU表/功能组成矩阵

最常见的是OTU表、各分类级物种组成；宏基因组的物种和功能组成表/矩阵。支持多列特征分级属性，但必须是严格的等级。多级时容易报错，通常只使用1或2级行名，如下表门和属对应样品中相对丰度。

Phyla    Genera    AM-AD-1    AM-AD-2    AM-F10-T1    AM-F10-T2
Bacteroidetes    Bacteroides    9.7172748    5.248866    1
Chlorobi    Prosthecochloris    0.0    0.0    0.0    0.0    0.0    0
Chloroflexi    Chloroflexus    0.0    0.0    0.0    0.0    0.0    0.0    0
Chloroflexi    Dehalococcoides    0.0    19.9791942    2.3873250

实验设计Metadata

一定要包括样品名和组名，可以有多种分组方式

Sample Id    Enterotype    Nationality    Clinical Status    Gender    Project    Clinical Status [filtered]    Nationality [filtered]    Gender [filtered]
AM-AD-1    Unclassified    american    healthy    F    gill06    na    na    na
AM-AD-2    Unclassified    american    healthy    M    gill06    na    na    na

多组比较——肠型

安装好软件，Load data打开example中的EnterotypesArumugam目录中的肠型数据(spf是数据矩阵，tsv是实验设计)，打开默认显示PCA结果如下：

展示PC1-3之间组合的散点图。图片大小、关闭其它轴、图例位置等可以下方Configure plot中设置，图例在右侧，每组不同颜色，可在Group field中选择实验设计中不同的分组，分组可通过勾选进行取消或选择，并实时显示分析结果。(大数据时，请点击右下角实时计算，减少等待时间)

重现肠型分类

选择右上角Group field为Enterotype，去除后三个非主要分组，只保留三种肠型；同时左侧的数据属性中，Profile level选择Genera，现在我们可以看到三种肠型的不同形状在图中分开比较明显。

属性面板功能简介

• Parent level：标准化的总体范围
• Profile level: 分析的具体级别，如科、属、种或OTU
• Unclassified: 末分类数据处理方法，分别为Retain保留、Remove移除和仅用于计算比例。不同处理方法，结果会很大差异。
• Statistical properties：统计属性，主要包括统计检验方法，事后检验方法和置信区间，效应大小，多重检验校正方法等的选择；
• Filtering: 过滤阈值，主要是设置P值和效应大小。修改后，下方同步有符合条件的结果数量。方便在查看图表结果时只关注符合条件的features。

图表类型介绍

比较常用的是两组比较，本软件对多组比较支持也非常好，很容易进一步探索数据。

• 柱状图：显示每个样品中feature的相对比例，并添加组均值，方便查看单个Feature的数据分布，如下图显示三种肠型中拟杆菌属的相对丰度。
  

注：Feature列表下方，可勾远Show active来只显示符合条件的结果。

• 箱线图：简单快速显示组内数据分布。

箱线图展示三种肠型中拟杆菌的相对丰度分布和整体统计P值

具体解析，可阅读 - 扩增子图表解读-理解文章思路

• 热图：显示每个Features在样品中丰度的比例，优热在于不仅显示所有样本的丰度值，更可以对行Features和列样品进行聚类显示之间的关系；
• 主成分分析PCA：散点图在低维空间显示高维数据间主要差异；
• Post-hoc图：多组统计检验的无效假设(如ANOVA或Kruskal-Wallis)是所有组相等。提供每对组间测量的P-value和效应大小。

扩展柱状图/事后图显示组间两两比较柱状图，及置信区间分布和P值。

图片的具体参数见Configure plot页面，可在File菜单中Save plot保存图片，有PNG位图，和PDF, PS， EPS, SVG共4种矢量图可选，推荐PDF格式方便查看和修改。

统计表导出

我们想导出统计结果的表格，方便发表文章作为原始数据，和进一步分析。

View —— Multiple group statistics table

可以看到特征Feature、P值、假阳性率FDR、效应大小、各组均值和标准差等。可选择全部或显示部分，Save保存表格至文件。(P12)

其它功能

全局设置：Setting - Preferences中可设置丰度过滤、bootstrap次数、图标签截短长度、轴颜色、其它样本颜色、和P-value阈值等

软件的扩展：可编写添加新统计方法和图表类型

统计方法

关于样本重复

需要多少样本才能检测统计显著？推荐阅读：Suresh and Chandrashekara (2012) and the article “Getting the Sample Size Right” by Jeremy Miles (http://www.jeremymiles.co.uk/misc/power/)。

我们的建议是没有最小的样本数，但统计假设必须符合数据分布。小样本量更可能不符合假设。小样本量也不太可能有足够的统计强度来鉴定效应大小。如t-test考虑每组4个样本，可以提供足够的准确度和精确度的信息。

样本数量也由样品本身决定，如果原始样本稳定且测量结果精度高，只需极少样本可决定统计差异，如不同面值硬币间重量差异，因为它们制作的精度高且准确称量较容易。

生物学数据充满了各种噪音，物种和功能组成也容易受多种因素影响，具有低准确度和精密度的特点。实验和分析每步都可能对想结果有影响，因此我们需要生物学重复，才能鉴定组间差异。如健康和疾病样本，有多种因素不可控，需要极大量样本才可能发现均值和方差显著的不同。(P6、原文Page|6)

多组比较

表1. STAMP中可用的多组比较方法，其中加粗为推荐方法(STAMP官方帮助文档P14)

分析两组

表2. STAMP中可用的多组比较方法，其中加粗为推荐方法(STAMP官方帮助文档P17)

分析两样品

表3. STAMP中两样品统计方法。推荐方法加粗。CC = 连续校正，DP = 比例差异，OR = 让步比，RP = 比例。

常见问题

读入文件错误

Data does not form a strick hierarchy. Child Unassigned has multiple parents.

它要求的输入分类级不允许在各级别有重名，而物种命名总有些不规范的级别和末命名的，所以建议将门、纲、目、科、属、OTU水平分别制作成spf文件给STAMP分析，可确保正常使用；

STAMP也提供了检查不符合要求的，非层级的分类检查脚本

wget http://kiwi.cs.dal.ca/Software/images/e/e6/CheckHierarchy.zip
unzip CheckHierarchy.zip
chmod +x checkHierarchy.py
# 一个使用RDP注释结果，发现4419条非层级结果，我想哭，完全无法使用
checkHierarchy.py result/otutab_stamp.spf | wc -l

# 检查结果如下
checkHierarchy v0.0.1: <program description>
  by Donovan Parks (donovan.parks@gmail.com)

Identified 3880 samples.
Identified 8 hierarchical columns.

The following entries have two (and potentially more) parents:
12      Order   Actinomycetales Actinobacteria,Alphaproteobacteria
35      Family  Rhodospirillaceae       Actinomycetales,Rhodospirillales
38      Family  Sphingobacteriaceae     Sphingobacteriales,Cytophagales
54      Order   Clostridiales   Clostridia,Acidobacteria_Gp21

末注释的最好统计标记为unclassified，上文提到有多种处理方法，但没有完美解决问题。

实验设计和丰度矩阵样品名不对应

Metadat warnings: Missing metadat for the following samples:

实验设计中缺失OTU表中的样品名，如果是人为注释或去除掉的，可以忽略此警告，否则仔细检查实验设计是否与矩阵中样品名对应

总结

分析三步曲：

整体：PCA plot，可通过不断筛选分组来观察组间整体差异

多组: 组间重复数3-15个，可用bar或boxplot逐个查看显著差异的OTUs，大于15个最好只用boxplot；组内样本波动大用boxplot更直观，波动小可选barplot+error bar也很漂亮。组间差异明显，组内重复好，可选热图+聚类信息更丰富。

两组：boxplot，barplot用原始数据。整体可用extended barplot

软件功能非常强大，但还是些局限性：如有些步骤不能选择原始数据统计；强行进行了标准化，这样对部分数据分析可能会有影响；软件无法保存工作状态、上次访问路径等；新项目必须关闭软件重新打开才能开始分析等。

Reference

• Parks DH and Beiko RG. (2010). Identifying biologically relevant differences between metagenomic communities. Bioinformatics, 26, 715-721.
• Parks DH, Tyson GW, Hugenholtz P, Beiko RG. (2014). STAMP: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics, 30, 3123-3124.
• 微生物组间差异分析神器-STAMP  
• STAMP：“花样”分析组间差异

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