眨眼五一假期已过，其实很大一部分做小麦的往往没有五一假期。今天我们想要说一说与microRNA的话题。前面我们谈过一些microRNA的话题，我整理了一下列在下面，感兴趣的可以去看看，也欢迎大家就small RNA方面的内容与我们交流。

今天要谈的这篇文章前几天刚刚在plant journal在线。文章的题目是“Identification and characterisation of a previously unknown drought tolerance—associated microRNA in barley”。作者系澳大利亚常春藤名校联盟“八大名校”之一的阿德莱德大学（The University of Adelaide）。通讯作者是Shi Bujun, 第一作者是Zhou Hui。文章的DOI是10.1111/tpj.13938，输入DOI可在网站sci-hub.tw上下载。

本文是一个反向遗传的例子，不像图位克隆这样正向遗传的文章，一换扣一环，逻辑方面较简单，文章阅读起来也相对容易，貌似小麦里图位克隆也比较简单，文章所呈现出来的内容也是行云流水。实际上在小麦做图位克隆并不简单，图位克隆过程中很多的曲折实际上很少会在文章中有所呈现。而反向遗传学方面，也即基因功能和机制的方面研究，很大程度上需要转基因技术和基因编辑技术，这才是反向遗传学的硬通货。除此之外，一些必要的点缀也是需要的，毕竟红花还得绿叶配。从一个简单的idea到最终论文里呈现的完美故事，统领整个研究的是逻辑思维能力，这才是一篇论文研究的灵魂所在。反向遗传学对逻辑方面的能力要求要比正向遗传学高。今天我们就以这一篇文章为例谈一谈。

首先先从文章的干货开始谈起。过表达hvu-miRX的大麦植株耐旱性与对照相比得到提高，表型见下图，文中也对一些耐旱性的指标进行了评价，结果也是阳性的。可能只是先在线的原因，图片里的文字看不清楚。

现在我们知道miRNA是通过剪切靶基因的转录本而行使生物学功能的，在表达水平上往往成相反的趋势，也即当miRNA的表达量升高时，靶基因的表达量就降低，反之亦然。这里为了行文的方便，miRNA和靶基因之间的关系做了简单化处理。在这里hvu-miRX的靶基因之一是编码NAD(P)-binding domain的基因，该基因的表达水平在过表达hvu-miRX的大麦里与对照相比降低了，这符合我们的预期。但是该基因不受干旱诱导。文中没有对此作出解释，其实我们可以做这样一个假设，含有NAD(P)-binding domain的基因负调控大麦的抗旱性。大家认为这个假设对不对呢？同时文中回避了过表达hvu-miRX的大麦在干旱处理过后，该靶基因的表达水平。所以hvu-miRX是否真的通过这个靶基因来提高大麦对干旱的耐受性还没有一锤定音，也即不能排除其他未知的途径。大家可以进一步思考下，如果要验证这个假设需要安排哪些实验呢？其实我认为这才是文章的亮点所在，然而本文并没有更进一步。

说完了转基因，我们再谈一谈这个研究的来龙去脉。这就不得不提2011年的两篇研究，一篇是在组学水平上鉴定大麦的miRNA（Discovery of barley miRNAs through deep sequencing of short reads），另外一篇发现在过表达TaDREB3的大麦里有一个miRNA与对照相比上调表达（Improvement of stress tolerance of wheat and barley by modulation of expression of DREB/CBF factors），同时过表达TaDREB3的大麦对干旱的耐受性增加。这是为啥本篇为啥要研究miRX。我们前面提到也有过表达miRX的大麦，但文中作者没有提到是否DREB3的表达是否受miRX调控，也许因为DREB3并不是miRX的靶基因吧。这其实也是一种常见的研究思路，先广撒网，再从捞到的鱼里挑挑拣拣，选择一条上好的鱼苗子养大。我们以前常说生信就是指路的也是这样一个道理，数据越多，方向也就更坚定，脚下的路也就越平坦。

接下来是对miRX的研究，希望说明miRX确实是一个miRNA，并且也确实收到干旱的诱导。除了这些，本文还发现pri-miRX的正向上有8个ORF，其中最长的一个编码65个氨基酸。前面已经有研究表明pri-miRNA是可以编码一些小肽的，本文没有再进一步去验证。获得的15个cDNA（pri-miRX）克隆中，有2个存在单碱基变异，作者认为很可能是反转录过程中引起的错误。是不是反转录引起的错误，多重复几次反转录是不是就可以验证了？另外有没有可能是RNA编辑？

这一部分在讨论里还提到pri-miRX的5'末端多了四个碱基GAAA。我们知道mRNA会在5'末端加帽，即加1个G，而这里却加了4个碱基？作者表示还需要更多的时间来研究GAAA可能的生物学作用。看到此处，我首先想到的有没有可能是接头序列？我查了下材料方法，本文使用的反转录试剂盒是GeneRacer，在附件一里看到其接头引物的3'末端就是GAAA，如下图。所以我不太清楚作者是否排除了加上的这四个碱基？有兴趣的小伙伴可以仔细研究下，看看这个GAAA是不是真的？

接下来作者继续分析了这个miRX的启动子序列。这里先卖个关子，大家想一下为啥要花很多精力分析和研究启动子呢？

作者在分析了一些启动子的基本元件后将启动子截成4段启动GUS，用来寻找核心启动子。通过数GUS的细胞数目的来衡量启动子效率的高低。由于我没做过这种实验和文中材料方法部分介绍也比较少，不了解这个实验的可靠性。有懂的小伙伴可以评价下。下图是结果的柱状图，因为文中没有交代该实验重复了几次，这个实验误差有点大，所以对文中所下的结论还是有点疑问的？

这里要交代为啥要研究miRX的启动子。因为在转TaDREB3的材料里，miRX上调表达，考虑到DREB3是一个转录因子，所以就假设DREB3通过结合其启动子区基序来调控miRX的表达。但是仅从启动子序列上来来看，没有迹象表明受DREB3调控,后续的共表达实验也没有证明DREB3直接调控miRX。

下面说一说miRNA的靶基因。预测得到15个靶基因，降解组支持的有3个。然而文中并没有交代支持靶基因的降解组read是多少，也没有具体交代使用了哪个组织的降解组文库，以及原始的降解组数据是否已提交至公共数据库。

有降解组支持的3个靶基因，选择了那个编码NAD(P)-binding domain的基因进行了验证（The target gene encoding the NAD(P)-binding domain-containing protein was further verified using gene specific 5′ RACE）。这里列出了文中的原话。按照我的理解如果要验证miRNA的靶基因，一般使用的是3' PPM-RACE和5' RLM-RACE。而这里作者所讲的5′ RACE是不是5' RLM-RACE我就不太确定了。在材料方法和附件里也没有对这一实验的描述。下图中3个黑色箭头上方的数字表示一共验证了8个克隆，其中有6个克隆支持在经典的10-11位之间剪切靶基因，当然这是按照我的理解，至于是降解组的read还是克隆，得向作者确认。这个地方最好再放上测序的峰图。

然而，定量PCR结果表明NAD(P)-binding domain-containing 的基因的表达没有发生变化。

除了以上内容，本文还分析了miRX在大麦基因组的拷贝数和位置，以及miRX在植物里的保守性。

以上就是本文的全部内容。建议大家有时间的话读读原文，结合本次的解读，希望能够有自己的思考。本文的亮点有两条，第一证明miRX受DREB3调控，第二证明过表达miRX的大麦对干旱的耐受性是通过哪个靶基因起作用。然而，本文在这两方面得到的都是阴性结果。本文对大部分实验结果的描述和分析很到位，这点是我要学习地方，写文章的时候几句话就把结果交代完了，在往下就没东西写了。而对实验方法部分的描述却很不到位，一些关键信息缺失。