成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序

溶液配方：

1. 无糖无钙台氏液NT（=）

2. 无钙台氏液NT(-)：取NT（=）配制

3. 酶解液（E液）：NT(-) + 胶原酶2 + 蛋白酶+BSA

30mL NT(-)+30mg collagenaseⅡ（以275U/mg计算） + 3mg protease + 30mg BSA

4. 酶解洗脱液(DE液)：NT(-)+BSA

50ml NT(-) + 50mgBSA

5. 上机检测液（T液）：NT（=）+ D-葡萄糖+ 1.8mMCaCl₂

300mL母液 + 0.54g D-葡萄糖 + 0.06g CaCl₂ (1mol/l,0.54ml)

6. CaCl₂溶液： 1M CaCl₂   0.2M CaCl₂

复钙液 CaCl₂溶液（0.2M）：10 mL CaCl₂=0.22gCaCl₂+10mL 水

复钙终浓度为1.8mM,根据细胞悬液体积计算：

如细胞悬液体积40mL,含钙：40mL*1.8mM=0.072mM;每次加CaCl₂40μL，其中含钙 40*0.2=0.008mM；共加：0.072/0.008=9次，

0  —  0.2  —  0.4 —   0.6 —  0.8 — 1.0— 1.4 — 1.8mM

40mL + 40μL  + 40μL  + 40μL +  40μL + 40μL+80μL+80μL  0.2M CaCl₂

实验步骤：

一、清洗心腔血液

1. SD大鼠腹腔注射5000 U/kg 的肝素，10 min 后, 用1% 戊巴比妥钠麻醉, 迅速开胸取心, 立即放入50mL氧饱和的 4℃无钙NT(-)液中，初步洗去心腔中血液，然后把心脏放入盛50mL氧饱和的 4℃无钙NT(-)液的培养皿中继续洗去心腔余血，同时持吸有NT(-)液的注射器并把主动脉套于有乳胶套的针头上，针头端部不能进入主动脉瓣，血管夹夹紧主动脉口，挂于langendorf灌流装置上，并用丝线结扎固定（如图A和B所示）。用50mL37℃无钙NT(-)液灌流心脏至液滴无色，流速为6 ml/min。

二、酶解心肌组织

2. 30mL 37℃酶解液灌流约33min至心脏变软，颜色变白。

三、洗脱消化酶，停止酶解

3. 消化酶洗脱液50mL37℃灌流约5min，取下心脏，置无菌40mL消化酶洗脱液。

四、复钙

4. 每隔5min.向溶液中加入分别40μL、40μL、40μL、40μL、40μL、80μL和80μL无菌0.2M CaCl₂溶液。（此时Ca²⁺浓度为1.8mM）

5.单细胞收缩系统检测心肌细胞收缩功能或收集细胞2.5%戊二醛固定。

6. 上机检测液洗两次，暗室中负载Fura-2 AM Ca²⁺荧光探针染色，500μL 台式液加1μL DMSO溶解的Fura-2 AM Ca²⁺荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上仪器检测。

注意事项：

1. 心脏灌流液中不能有Ca²⁺，因为Ca²⁺抑制心肌细胞分离，减少细胞收益率。

2.  心肌细胞分离溶液中不要加入EGTA或EDTA，它们均是Ca²⁺螯合剂，它们会损害心肌细胞和抑制酶活性。

3.溶液的PH=7.35。

4. 如果动物小，心脏酶解时间应缩短。

5. 一次性吸管端部要钝化。

6. 双层纱布过滤心肌细胞。

7. 为了延长细胞的寿命，心肌细胞应该保存于4-8℃的环境中。

8. 可用0.4%的台盼蓝（用0.01M PBS配制）染色，用血球计数板计数并求得存活率。

9. 可用50g 离心5min沉淀细胞。

10. 高浓度酶溶液或长时间酶解都会损伤细胞质膜和膜整合受体。

11. 固定刚分离的心肌细胞可以先用洗脱液除去死去的细胞再固定。

12.所有溶液都要用O₂饱和。

13.洗掉心脏血液的为4℃的O₂饱和无钙台式液。

KB液   现用现配（不用过滤）  （PH=7.3，KOH调节）（分离心肌细胞保存液，可以使心肌细胞保存约24h，且保持活性）