脂酶同工酶和过氧化物酶同edit.pdf

几个小麦高矮杆品种中过氧化物酶和酯酶与株高的相关性

严海燕¹ 张开旺¹ 徐乃瑜¹

¹武汉大学生命科学院 武昌，珞珈山

摘要 我们采用不同发育时期的高、矮杆亲本与正反交杂种（F0）种子的酯酶(EST)、过氧化物酶(POD)酶谱进行了比较研究，并对一些农艺性状之间的相关性进行了测定。结果表明不同株高品种在拔节期节和节间组织的酯酶D带、过氧化物酶的酶带着色强度和酶活与株高呈显著负相关；在其他发育时期，这些同工酶酶谱和酶活未表现出相关性。此外芽鞘与株高呈高度正相关（=0.9997），在拔节期茎的伸长速度与株高呈正相关，这对小麦矮化育种筛选矮杆亲本和对杂交后代选拔优良矮杆单株提供一个早期能预测的简便方法。

关键词：过氧化物同工酶、酯酶同工酶、株高、拔节期、芽鞘

同工酶分析是一个强有力的工具，广泛应用于医学、生物学、分类学、病理学、遗传学、育种学等领域。在植物方面，人们已把同工酶技术应用于发育生理、基因定位，在品种资源研究方面，用于种间变异、地理分布及起源中心的探讨。酯酶和过氧化物酶是植物生长过程中起重要作用的两类酶。小麦的株高不仅与抗倒伏有密切关系，也与生物产量及经济性状有密切关系。因此探讨株高与过氧化物酶、酯酶同工酶酶谱的关系，在育种及基础研究方面都有重要意义。本研究对不同株高品种及对高、矮杆亲本和杂交后代的酯酶、过氧化物酶酶谱和酶活进行了分析，以期找出与株高相关的特异谱带，为育种提供生化鉴别指标。

1 材料和方法

材料：矮杆：矮苏二号、矮杨三号、矮变一号、Oleson

高杆：苏麦三号、鄂麦6号 中杆：杨麦三号

杂交亲本：矮变一号、鄂麦6号  及其F0代杂种

田间工作：

 所有材料于11月11日在田间播种， 22日出苗。株距5cm,行距25 cm。分别在拔节期、乳熟期、完熟期取材制样。

样品制备：

萌动胚：每品种取60粒，在17°C温箱内浸种24h。取露白种子切胚制样，每10粒种胚加蒸馏水0.5ml室温下研磨，经3500rpm离心20分钟，取上清液，按1：1加10%甘油，于-10°C冰箱中保存。

芽鞘：每品种取80粒，于20°C温箱内浸种萌发。第一片真叶即将露头时切取芽鞘制样。按每10个芽鞘加蒸馏水0.4ml研磨制样，方法同上。测量20株芽鞘的长度求其平均值。

节和节间：田间材料拔节期，取茎长9-20cm的植株节和节间制样。统计20株茎长。按每克加3ml蒸馏水制样，方法同上。

完熟种子：取完熟期种子，每10粒种子加蒸馏水1ml研磨制样，方法同上。

同工酶检测和酶活测定方法：

本实验采用的同工酶分析分离法均为聚丙烯酰胺凝胶垂直薄板电泳。酯酶采用的缓冲系统为低离子强度的Tris-柠檬酸缓冲系统（.pH8.9），凝胶浓度下层胶为7.3%，上层胶为2.5%，电极缓冲系统为低离子强度的Tris-Gly系统（pH 8.7）。每样槽点样80ml和1滴溴酚蓝。电泳电压为200-260v/每板，时间3~4小时。染色用1mg/ml的醋酸-a-奈酯加1mg/ml 的坚牢蓝（RR盐）,在染液中37°C染色10~15分钟，即可出现棕色酶带。

过氧化物酶采用Tris-HCl缓冲系统下层胶浓度为7%（pH 8.8）, 上层胶浓度为4%（pH 6.8）。 电极缓冲液系统为高离子强度的Tris-gly系统（pH 8.8）。每样槽点样80ml和1滴溴酚蓝。电泳电压为每板100~200v，稳压电泳。电泳时间11~18h。 染色采用1mg/ml的联苯胺加少量的30%H₂O₂(1.0g+ 9 ml 冰醋酸+dH₂O 40 ml + 0.3%H₂O₂ 50 ml )，室温下染色半分钟到一分钟，看到酶带显兰色，即取出放入流水中冲洗过夜，酶带渐变成亮棕色。

过氧化物酶酶活测定:反应液由2.5ml pH 5.0柠檬酸缓冲液，0.25 ml 3%H₂O₂, 0.25 ml 2%邻苯二胺和0.25ml 3%酶液组成。加入酶液混合后，即放入30°C恒温水浴准确保温12分钟，加入0.5 ml30%亚硫氢酸钠溶液终止反应，于450nm下在721分光光度计中测O.D值，酶活以O.D(450)/mg蛋白表示。蛋白含量用紫外分光光度法测得。每个实验有两个重复。

2．结果与分析

2．1 几种生物性状的研究

表一描述了高矮杆品种的几种生物学性状。对芽鞘长度和株高进行差异显著分析，g值为0.997（n=4），相关性极为显著。可以看出，不同品种芽鞘的长度与株高呈高度正相关。

表1  几种高、矮杆品种的生物学性状

茎长在高、矮杆两类品种间与株高呈正相关，而在同类中没有差异。由此可见，芽鞘和茎长是与高矮品种间株高密切相关的重要指标。

2．2 小麦萌动胚过氧化物酶酶谱、酶活与株高、千粒重的关系

表2 小麦萌动胚POD酶活与株高、千粒重关系表

如表2所示，萌动期POD酶活的变化与千粒重和株高间没有规律性的关系。四个品种间过氧化物酶谱比较，品种间酶带的数目、着色强弱有差别，但与高矮没有规律性的关系（图1）。

四个品种间酯酶同工酶的酶谱也有差异，但与株高之间没有规律性的关系（图2）。

图1 不同株高品种萌动期过氧化物酶酶谱     图2不同株高品种萌动期酯酶酶谱

 强带   次强带  弱带  次弱带

2．3 小麦芽鞘POD酶活、POD和EST 酶谱与芽鞘长度、株高、千粒重的关系

表3小麦芽鞘POD酶活与芽鞘长度、株高、千粒重的关系

在同一类品种中，芽鞘中POD酶活与株芽鞘长和千粒重没有明显规律性关系。而高、矮品种间株高与千粒重呈相反关系。从POD酶谱看，两个矮杆品种比高杆品种多了一条带，但多出的带是不同的带。这两条多出的带可能与芽鞘长度和株高的差异有关。芽鞘酯酶酶谱的变化与株高和粒重没有明显关系。

2．4小麦拔节期POD酶活、POD和EST 酶谱与茎长、株高、千粒重的关系

图3不同株高品种芽鞘期过氧化物酶酶谱    图4不同株高品种芽鞘期酯酶酶谱

 强带   次强带  弱带  次弱带

表3 小麦节和节间POD酶活与茎长、株高、千粒重关系

虽然两个高杆品种的节间POD酶活都低，但矮杨3号的POD酶活与它们处于同一水平，很难说节间POD酶活的高低与株高直接相关。而千粒重却与POD活性呈反相关的趋势。即三个千粒重较高的品种节间POD活性较低（表3）。

节间过氧化物酶谱分析表明，C、D、E、L四条带在矮杆品种中较强（图5），在高杆品种中较弱。这四条带可能与株高有关。千粒重与两个高杆品种较接近的矮杨3号，其F、G、H带的强度与两个高杆品种的同一条带相同。此外，矮杨3号的D带弱于其它两个矮杆品种的相同带，但又强于两个高杆品种的相同带，这种差别与其千粒重和两类品种的差异趋势正好相反，表明 F、G、H、D可能与千粒重有关。

节间酯酶酶谱中（图6），两个高杆品种的D带都弱于三个矮杆品种的D带，表明这个酶可能与株高有关，且呈负相关。

图5 不同株高品种节间过氧化物酶酶谱         图6不同株高品种节间酯酶酶谱

 强带   次强带  弱带  次弱带

2.5 高矮杆品种杂交后代与亲本的成熟期子粒POD、EST同工酶比较

2．5．1 POD同工酶

亲本矮变1号 与鄂麦6号比较，在A-I九条带中（图7），鄂6无G带，矮变1号无D带。鄂6 x矮变1号(F0)则具有亲本的两条带（G、D），矮变1号x鄂麦6号具有双亲的所有酶带，呈显性互补（图7）。

2.5.2 EST同工酶

两亲本比较，鄂麦6号有A带，无B带，矮变1号有B带，无A带。正反交两个杂种一样，均具有亲本矮变1号的B带，和亲本鄂麦6号的A带（图8）。

以上两种酶的酶谱分析，都说明杂种中酶带有互补现象。

3 讨论

过氧化物酶广泛存在于植物各组织中。它的影响是多方面的。对过氧化物酶多方面的研究表明，它与整个代谢水平有关^[1]，它是通过破坏生长素而起作用的^[2]。POD酶含量标志着植株中异化作用的总水平。推测各个发育时期，POD与当时的生长中心都有密切联系。拔节期的生长中心是茎的伸长，它直接影响到株高，因而此时期POD酶对株高的影响较大。我们的试验结果与前人的一致^[3]，都表明酶谱着色强度和酶活与株高呈高度负相关。我们的试验结果还指出，拔节期酯酶酶带着色强度与株高也呈负相关, 这种差别仅在于酶带的强弱，而且与酶活一致，可以认为高矮杆间控制节和节间基因本身无差别，而是基因表达过程中控制的差别。另外，具有杂种优势的后代一般都具有互补酶带，如果正反交结果相同，则互补酶带是由核基因编码。在我们的实验中，高矮杆品种正反交杂种（F₀）成熟种子中的酯酶、过氧化物酶酶谱分析均发现有互补酶带。它们可能是结合亲本核基因作用的结果。

图7 杂种F0及其亲本完熟期POD酶谱   图8杂种F0及其亲本完熟期EST酶谱

 强带   次强带  弱带  次弱带 极弱带

在供试材料中，同一材料在不同发育时期，不同品种在同一发育时期的酯酶、过氧化物酶酶谱和酶活都有差异。这些资料和前人的结果一致^[4]，说明同工酶酶谱是受基因的调控所决定。

参考文献

1. 刘文芳，肖翊华，王桃珍 过氧化物酶同工酶，游离组蛋白与杂交水稻及其三系关系的研究。湖北植物生理学会第三届年会暨学术讨论会。1983年3月

2．郑康乐。小麦株高及粒重与过氧化物酶活性的关系 农业科技译丛 1981，37（ 1）：23-

3.韩雅珊等。过氧化物酶与作物高矮生特性间的相关性 北京农业大学资料汇编1981 42

4．王许莲，徐乃瑜 小麦不同发育时期酯酶、过氧化物酶同工酶酶谱的比较研究 武汉植物学研究1983 1（1）：17-20