几个小麦大小粒品种中酯酶、过氧化物酶和a-淀粉酶与粒重的相关性

严海燕^1,2 张开旺¹徐乃瑜¹

¹武汉大学生命科学院 武昌，珞珈山

几个小麦大小粒品种中酯酶、过氧化物酶和.pdf

摘要 我们采用不同千粒重的小麦品种，在不同发育时期进行酯酶、过氧化物酶和a-淀粉酶同工酶酶谱的分析，研究它们与千粒重的关系。研究结果表明，与千粒重直接有对应关系的是乳熟期种子中的a-淀粉酶的B带，它在所有大粒品种中存在，而在所有小粒品种中不存在。乳熟期种子中的a-淀粉酶的C带、酯酶的A带、萌动胚中a-淀粉酶的F、H、I带有可能参与多种基因对粒重的控制过程，而起间接作用。

关键词：过氧化物同工酶、酯酶同工酶、a-淀粉酶、千粒重

小麦的粒重是一个与产量密切相关的农艺性状，受多基因控制。酯酶、过氧化物酶是 植物体内具有多方面生理功能的酶。其同工酶分析广泛用于发育、品种鉴定、杂种分析、病理分析等方面。a-淀粉酶参与淀粉代谢，在粒重性状方面可能有重要影响，本研究针对小麦粒重的一对性状，对几个不同粒重的品种进行同工酶分析，以期找到规律性的酶带。

1 材料和方法

材料：大粒小麦品种：红芒、视察15、野园=野生二粒x园锥F5

小粒小麦品种：小荆早21、火烧百日、软杆洋麦

田间工作：

 所有材料于11月11日在田间播种， 22日出苗。株距5cm,行距25 cm。分别在拔节期、乳熟期、完熟期取材制样。

样品制备：

萌动胚：每品种取60粒，在17°C温箱内浸种24h。取露白种子切胚制样，每10粒种胚加蒸馏水0.5ml室温下研磨，经3500rpm离心20分钟，取上清液，按1：1加10%甘油，于-10°C冰箱中保存。

芽鞘：每品种取80粒，于20°C温箱内浸种萌发。第一片真叶即将露头时切取芽鞘制样。按每10个芽鞘加蒸馏水0.4ml研磨制样，方法同上。测量20株芽鞘的长度求其平均值。

节和节间：田间材料拔节期，取茎长9-20cm的植株节和节间制样。统计20株茎长。按每克加3ml蒸馏水制样，方法同上。

乳熟种子：取乳熟后期种子，每10粒种子加蒸馏水0.5ml研磨制样，方法同上。

完熟种子：取完熟期种子，每10粒种子加蒸馏水1ml研磨制样，方法同上。

同工酶检测和酶活测定方法：

本实验采用的同工酶分析分离法均为聚丙烯酰胺凝胶垂直薄板电泳^[1]。酯酶采用的缓冲系统为低离子强度的Tris-柠檬酸缓冲系统（.pH8.9），凝胶浓度下层胶为7.3%，上层胶为2.5%，电极缓冲系统为低离子强度的Tris-Gly系统（pH 8.7）。每样槽点样80ml和1滴溴酚蓝。电泳电压为200-260v/每板，时间3~4小时。染色用1mg/ml的醋酸-a-奈酯加1mg/ml 的坚牢蓝（RR盐）,在染液中37°C染色10~15分钟，即可出现棕色酶带。

过氧化物酶采用Tris-HCl缓冲系统下层胶浓度为7%（pH 8.8）, 上层胶浓度为4%（pH 6.8）。 电极缓冲液系统为高离子强度的Tris-gly系统（pH 8.8）。每样槽点样80ml和1滴溴酚蓝。电泳电压为每板100~200v，稳压电泳。电泳时间11~18h。 染色采用1mg/ml的联苯胺加少量的30%H₂O₂(1.0g+ 9 ml 冰醋酸+dH₂O 40 ml + 0.3%H₂O₂ 50 ml )，室温下染色半分钟到一分钟，看到酶带显兰色，即取出放入流水中冲洗过夜，酶带渐变成亮棕色。

a-淀粉酶采用的缓冲系统、凝胶浓度、电极缓冲系统、电泳时电压、时间都与酯酶相同。不同处仅在于在凝胶中加有7%可溶性淀粉及Na2SO4（2%）。染色前先用保温液冲洗一下，在保温液中（36C）保温半小时。保温液为Ca、Na的醋酸缓冲液（pH 5）。染色用碘化钾-碘液负染，几分钟后呈蓝黑色，随即放入固定液（冰醋酸：甲醇：水=40：100：320）中固定。

2．结果与分析

2．1 几种生物性状的研究

表1 几种大小粒小麦品种的生物学性状

从表1中可见，大粒的千粒重与穗长、有效小粒数、每穗粒数之间的关系没有明显的规律。

2.2 萌动胚几种同工酶谱的分析

萌动期POD和酯酶酶谱在不同品种间有变异（图1、图2），但看不出与千粒重的直接关系。虽然此时期的所有大粒品种的a-淀粉酶酶谱都有小粒品种荆早21和软杆洋麦所没有的J和H带，但小粒火烧百日也有这两条带，因此很难确定这两条带与千粒重有直接关系（图3）。另外，所有小粒品种和大粒品种野园都有F带，同样难以确定与粒重的关系。

2．3 不同千粒重小麦品种的芽鞘几种同工酶酶谱的分析

对不同千粒重小麦品种的芽鞘POD和EST酶谱进行了分析，所有品种的POD和EST酶谱完全相同，没有差异（图4，图5），表明芽鞘中的POD和EST活性与千粒重无关。

2.4 不同千粒重小麦品种的乳熟种子几种同工酶酶谱分析

比较大小粒小麦乳熟期a-淀粉酶酶谱（图6），所有大粒小麦乳熟种子的a-淀粉酶都有一条B带，而小粒乳熟种子没有，这条B带很可能与大粒有关。

另外小粒的荆早21和软杆洋麦都有一条C带，软杆洋麦特有一条F带，荆早21特有J、K带，很难看出这些带与千粒重有直接的相关关系。

两个大粒小麦品种视察15、野园和小粒品种火烧百日乳熟种子酯酶比其他品种多了一条A带（图7）。在小粒品种乳熟种子中，只有火烧百日酯酶有A带，而其他两个品种的a-淀粉酶都有C带，这个C-带a-淀粉酶与A带酯酶的存在是否存在相斥的关系，有待于进一步探讨。

图1 不同千粒重小麦品种萌动胚POD酶谱      图2 不同千粒重品种小麦萌动胚EST酶谱

强       次强 弱  次弱

图3不同千粒重小麦品种萌动胚a-淀粉酶酶谱         图4 不同千粒重小麦品种芽鞘POD酶谱

图 5 不同千粒重小麦品种芽鞘EST酶谱             图 6  不同千粒重小麦品种乳熟籽粒a-淀粉酶酶谱

图7 不同千粒重小麦品种乳熟籽粒酯酶酶谱              图8 不同千粒重小麦品种成熟籽粒a-淀粉酶酶谱

2.5 不同千粒重小麦品种的成熟种子几种同工酶酶谱分析

成熟籽粒的a-淀粉酶在大小粒品种间没有规律性的变化（图8），而酯酶酶谱中，所有大粒品种都有一条D带，但小粒的荆早21 也有这条D 带。

图9 不同千粒重小麦品种成熟籽粒酯酶酶谱

3、讨论

不同品种间的同工酶的差异通常有几种情况：1.直接与性状相关的差异，这种差异表现在某条或某些带的存在与否直接与性状相对应，本研究中小麦乳熟种子a-淀粉酶的B带就是这种情况，它的存在与大粒的性状直接对应，表明这个同工酶与千粒重有关。2.与性状关系有一定关系，但不明显，有可能是几个基因的作用造成。本实验中小麦乳熟籽粒酯酶同工酶的A带, 在小粒品种的火烧百日中存在，其他两个品种中不存在。两个大粒品种视察15和野园也有A带。而乳熟籽粒的a-淀粉酶同工酶的C带在小粒的其他两个品种中存在，火烧百日中不存在。它们之间的关系是否与粒重有关，很难说清。象这种情况的还有成熟籽粒酯酶的D带，所有大粒品种和小粒荆早21有；萌动胚的a-淀粉酶的F带，所有小粒品种和大粒品种野园有；萌动胚a-淀粉酶的H、I带，所有大粒品种和火烧百日有。3、没有密切关系。

在植物每一个发育时期，都有一个生长中心。不同时期的生长目的不同，而各个时期的生长相互影响。小麦的籽粒形成的乳熟期是贮藏物质形成的重要时期，与粒重有重要和直接的关系。淀粉是小麦的主要贮藏物质，与淀粉合成有关的酶应当是决定粒重的重要因素。参与淀粉合成的不仅有几个合成酶类，淀粉酶也可能起着重要作用，它可能在支链淀粉合成过程中起着修饰链长的作用，而支链淀粉是淀粉中的主要成分。乳熟期a-淀粉酶的B带与粒重的关系证明了这点。

粒重性状是通过一系列反应，通过复杂的网络调控造成的，许多因素会在其中起作用，作用的大小也由相应基因在网络中的功能而决定。若要彻底查清与千粒重有关的机理，需要利用现代分子生物学技术，从基因表达、代谢产物、各种酶的活性、生物学性状等进行全面的分析。

4 参考文献

1.       植物同工酶及其测定技术 武汉大学生命科学院遗传专业实验教材 1980