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[转载]铁死亡的重要发现(2022)

已有 1327 次阅读 2024-2-28 10:50 |系统分类:科研笔记|文章来源:转载

铁死亡十周年!为表纪念,发现者于66分的Cell正刊推出重磅综述,我劝你赶紧收藏!

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铁死亡(Ferroptosis)这一概念最早在 2012 年由 Dr. Brent R Stockwell 提出,它是一种铁依赖性的脂质过氧化、活性氧自由基大量累积所致的细胞死亡模式。铁死亡也引起了癌症研究界的极大兴趣,其在肿瘤生物学和癌症治疗中的研究已经取得了实质性进展,今年刚好是铁死亡被发现的第十年。

在2022年7月7日,为纪念铁死亡十周年,铁死亡的发现者、现任职于纽约哥伦比亚大学的 Dr. Brent R Stockwell 在Cell(IF= 66.85)上发表了题为《Ferroptosis turns 10:Emerging mechanisms, physiological functions, and therapeutic applications(铁死亡的十年:新兴机制、生理功能,及其治疗应用)》的重磅综述。该综述从细胞代谢、活性氧生物学和铁生物学等方面系统阐述了铁死亡的关键调控因子,重点介绍了铁死亡领域的关键概念和主要未解问题。

摘要

铁死亡(ferroptosis)是十年前发现的一种独特的细胞死亡方式,由铁依赖的脂质过氧化驱动,并因此得名。铁死亡与多种生物学景况密切相关,包括发育、衰老、免疫与癌症。这篇综述将在新陈代谢、活性氧生物学和铁生物学的框架体系内探讨铁死亡的关键调节因子,并将重点介绍铁死亡领域的重要概念和主要的待解决问题,以期在未来的十年中,有望在铁死亡的调控机制以及利用铁死亡来促进治疗方面,取得进一步突破。

铁死亡简介

十年前,我(即本文作者Brent R. Stockwell,下同)的实验室首次引入了铁死亡这一术语,用来描述一种由脂质过氧化驱动的,依赖于铁的,受调控的,独特细胞死亡形式。(图1)铁死亡并不同于细胞凋亡等其他形式的细胞死亡方式。其发现可以追溯到我们在2003年发现的一类诱导非凋亡形式细胞死亡的小分子。这类小分子以铁依赖的形式调节细胞死亡,并对分子水平的扰动高度敏感。同时,根据Marcus Conrad 等人在2008年的发现,控制细胞氧化还原稳态的关键基因参与调控了这种非凋亡形式的细胞死亡。

图1

在引入铁死亡这一概念之前,有三个重要的领域相互交错汇集,为我们理解现在所说的铁死亡领域打下了基础:(1)细胞代谢机制,(2)活性氧(ROS)的调控,(3)铁的调节。

首先,对氨基酸和脂质代谢机制的理解为铁死亡的发现提供了基础。1955 年,Harry Eagle 的研究发现氨基酸半胱氨酸(cys)对于小鼠成纤维细胞株L和Hela细胞系的存活和生长至关重要;1973 年,Jerry Mitchell 发现对乙酰氨基酚引起的大鼠肝性坏死是谷胱甘肽 (GSH) 和cys依赖性的。Shiro Bannai在1977年的研究发现,胱氨酸(cys的氧化形式)的消除会造成GSH 耗竭相关的细胞死亡,可以通过摄入维生素E来预防。

同时,众多研究阐明了脂质代谢的关键机制。Michel Eugene Chevreul于1823年分离出了脂肪酸,1929年,Burr夫妇George和Mildred发现并报道了多不饱和脂肪酸(PUFA),例如大鼠饮食的基本成分:亚油酸(18:2,其中 18 代表脂肪酸中的碳数,2 代表双键的数量)和亚麻酸(18:3)。1813 年 Nicolas-Louis Vauquelin、1846 年 Theodore-Nicolas Gobley 和 1874 年 Johann Wilhelm Thudichum 的研究发现了磷脂 (PLs),这是细胞膜的关键组成部分。当PUFA是膜脂(如PLs)的一部分的时候,它将成为铁死亡的过氧化底物。

其次,研究人员阐明了生物分子氧化损伤的生物学意义。氧化剂过氧化氢由 Louis Jacques Thenard 在 1818 年合成,分解H2O2 的生物学机制由 Christian Friedrich Schonbein 在 1863 年、Oscar Loew 在 1900 年、Otto Warburg 在 1923 年、Kurt Stern 在 1930 年代和 Gordon Mills 在1965 年逐一解析。1980 年,Shiro Bannai 和 Emi Kitamura 发现了系统xc-(system xc-)是摄取胱氨酸的反向转运蛋白,胱氨酸是谷胱甘肽(GSH)的氨基酸类关键组成成分(图 2)。

图2

GSH可以阻止过氧化氢等氧化剂引发的“氧化应激(oxidative stress)”(这是 Helmut Sies 在 1985 年创造的一个术语)。此外,硒也涉及了保护细胞免受氧化应激的关键调控轴。硒由 Jons Jacob Berzelius 于 1818 年发现。1982 年,Fulvio Ursini 及其同事发现了一种硒蛋白,谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4),可作为一种 GSH 依赖的过氧化物酶来对抗细胞膜上脂质的氧化。然而,Marcus Conrad 及其同事在 2018 年报告,在 C57BL/6J * 129S6SvEv 小鼠中,用半胱氨酸取代 GPX4 中的硒代半胱氨酸活性位点残基仅会影响大脑中的特定中间神经元。值得注意的是,用半胱氨酸替换 GPX4 活性位点的硒代半胱氨酸会导致 C57BL6 小鼠胚胎致死,这表明 GPX4 中对硒代半胱氨酸的需求存在环境依赖性。

第三,研究人员发现了铁及其代谢的生物学重要性。1713 年 Lemery 和 Geoffroy 在人体中发现了铁,1876 年,Henry John Horstman Fenton 发现铁盐可与过氧化物反应产生羟基自由基,提出了现在以他的名字命名的反应(Fe2+ + HOOH / Fe3+ + OH- + OH.)。1937 年,Vilem Laufberger 成功结晶并发现了一种重要的铁储存蛋白——铁蛋白,它将铁螯合为 Fe(III),以防止芬顿反应。1945 年,Carl Holmberg 和 CarlBertil Laurell 发现了以转铁蛋白 (Tf) 形式进行的铁转运的主要机制。研究发现,小鼠对细胞内病原体的抗性由被称为“天然抗性相关巨噬细胞蛋白”(NRAMP1)的基因控制。还有别的研究发现了一个相关基因,将其称为NRAMP2,DMT1铁转运蛋白的发现便源于此。Nancy Andrews发现NRAMP2,后来更名为DMT1,是小鼠小红细胞性贫血的遗传原因,也是研究人员在长期寻找的铁转运蛋白。连同铁输出蛋白ferroportin(FPN)的发现,这些研究为我们理解铁在细胞内的稳态奠定了基础。

同时,称为细胞凋亡的细胞死亡形式背后机制也已被阐明。随后,一种的非凋亡的受调控细胞死亡方式被鉴定炎症性细胞死亡,被命名为细胞焦亡(pyroptosis);同时鉴定出一种受调控的坏死(necrosis)方式,称之为程序性坏死(necroptosis)。同时,2001 年至 2003 年,我的实验室对 HRASV12进行选择性致死小分子高通量筛选,并由此发现了一种新化合物,我们将其命名为 erastin(用于杀灭RAS 突变细胞),它能够诱导非凋亡的细胞死亡,这种诱导效应取决于氧化应激水平和细胞铁的积累。我们进一步进行了更大范围的筛选,并筛选到了新的化合物,其中就包括 RAS-selective-lethal-3 (RSL3),它同样诱导非凋亡的、铁依赖的氧化型细胞死亡。2008 年,Marcus Conrad等人的研究报道,GPX4的遗传缺失诱导了一种由脂质过氧化驱动的非凋亡细胞死亡,这种死亡方式可以被α-生育酚抑制,同时过表达系统xc-轻链可以保护细胞免受这种由脂质过氧化诱导的非凋亡细胞死亡。2012 年,我和包括 Scott Dixon在内的实验室成员提出了一种铁依赖的受调控的细胞死亡的概念,它不同于细胞凋亡、不受调控的坏死和程序性坏死,我们称之为铁死亡。

我们发现,erastin通过抑制xc-系统摄取胱氨酸,导致cys和GSH的耗竭,来诱导铁死亡。而RSL3诱导铁死亡的分子靶标是GPX4,早期报道GPX4控制一种非凋亡形式的氧化性细胞死亡,与这一发现一致,同时GPX4也被确定为铁死亡调控的中心。

铁死亡被定义为一种由脂质过氧化介导的铁依赖性细胞死亡形式。这可以在细胞培养中通过铁螯合剂和亲脂性的抗氧化剂是否逆转细胞死亡来鉴定。在人类和动物组织样本中,铁依赖性脂质过氧化标志物的存在可用于识别铁死亡的存在(见下文)。

自2012年以来,已在多种生物学系统中鉴定到铁死亡——它作为器官损伤的驱动因素存在,作为一种由内源性修复和保护系统控制的古老细胞死亡形式存在,并且在Tf 和氨基酸谷氨酰胺存在且缺乏半胱氨酸的情况下,作为一种培养小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)被激活的细胞死亡模式存在。在不同系统中反复观察到的铁死亡揭示了这种细胞死亡发生的普遍性。

在这篇综述中,我提供了一个框架,用以理解大量新兴的,数量在过去十年中呈指数增长的文献。关于这种铁依赖性的过氧化细胞死亡形式:铁死亡处于新陈代谢、ROS和铁调节机制的生物学的交叉处,而这三个领域中的每一个都有助于我们理解铁死亡的机制、生物学意义和临床治疗相关性。我在这个框架内描述了铁死亡调控机制的最新进展,包括控制铁死亡的细胞器,以及铁死亡的正常生理功能。此外,我总结了涉及铁死亡的关键病理背景和调控铁死亡的新兴治疗应用。最后,我阐明了一些助于理解铁死亡的有用概念,以及可能推动未来十年铁死亡研究的关键未解决问题。

铁死亡的机制

在过去十年中,尤其是近几年,我们对铁死亡的调控机制的理解取得了重大进展,这反过来又影响了我们如何概念化铁死亡在生物学和医学中的作用。如下所述,许多研究阐明了在铁死亡期间经历氧化并驱动细胞死亡过程的特定脂质、抑制铁死亡的内源性机制、控制铁死亡敏感性的铁代谢调节的关键机制,以及参与铁死亡的细胞器。我在新陈代谢、活性氧生物学和铁调节的交叉处为中心的框架内,总结了铁死亡的范式。

1、代谢产生的铁死亡的底物和铁死亡的天然抑制剂

为了铁死亡的发生,特定的脂质必须经历过氧化,且阻止过氧化脂质积累的天然防御机制必须受损(图 2)。细胞在正常代谢过程中,一方面产生过氧化脂质的底物和氧化剂,另一方面产生防止脂质过氧化的抑制剂。

2、脂代谢:ACSL4和LPCAT3生产铁死亡的脂质底物

铁死亡是由特定膜脂的过氧化作用进行最终驱动的(图 2)。只有脂质中的特定碳原子易受过氧化作用,因为该反应涉及过氧基 (O-O)取代与碳原子相连的氢原子;因此,脂质发生过氧化的倾向取决于其碳氢键的强度(图 2)。由于在相邻的C = C双键之间存在异常弱的 C-H 键,因此PUFA特别容易发生过氧化。因此在最初,人们认为游离PUFA似乎就是铁死亡的驱动因素。然而发表于2015年至2017年的几篇论文表明,游离脂肪酸并不是铁死亡的驱动因素,而是需要活化PUFA并将其掺入膜脂(如PLs)中,以便产生致命性的过氧化物。鉴定驱动细胞死亡的特定脂质,以及促进其生成和掺入细胞膜的酶,是过去十年铁死亡研究的一个重要发现。

在以单倍体为主的细胞系KBM7中进行的插入诱变筛选显示,乙酰辅酶 A (CoA) 合成酶长链家族成员 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3 (LPCAT3) 的失活使这类细胞对两种不同的 GPX4 抑制剂具有抗性——第一种是GPX4 抑制剂 RSL3,以及另一种名为 ML162 的化合物。此外,铁死亡抗性细胞的CRISPRi筛选分析独立地得出,ACSL4 失活是一种在不同情况下抑制铁死亡的关键机制;此外,在这种情况下,ACSL4 的过表达对铁死亡敏感。鉴于 ACSL4和LPCAT3 参与活化和整合 PUFA——如花生四烯酸 (AA)——进入膜定位的脂质,说明PUFA需要存在于其膜结合环境中以表现过氧化后的杀伤力(图2)。因此,尽管系统 xc-和GPX4通常作为铁死亡的强抑制因子发挥作用,ACSL4和LPCAT3仍是第一个确定的促铁死亡基因产物,因为它们在促进PUFA掺入膜脂中发挥着作用(图2)。

最近的一份报告表明,ACSL4还积极参与正反馈循环以执行铁死亡:蛋白激酶 Cβ型同工型 2 (PKCbII) 感知初始脂质过氧化事件,并磷酸化ACSL4的Thr328位点以驱动ACSL4的激活,还促进PUFA掺入PL 并驱动随后的细胞死亡。通过信号通路调节ACSL4的水平也是调控铁死亡的一个手段:E-钙粘蛋白通过Merlin-Hippo-YAP通路发挥作用,通过调节 ACSL4 的表达以响应细胞间接触来调控细胞对铁死亡的敏感性。因此,ACSL4可能更类似于细胞凋亡的刽子手caspase-3,它是细胞死亡的执行者,而不是管家蛋白。

其他ACSL酶家族也可以调节铁死亡:一些植物产生的共轭亚麻酸(例如α-桐酸)需要 ACSL1才能发挥其促铁死亡活性。此外,单不饱和脂肪酸 (MUFA),如油酸,需要ACSL3才能发挥抗铁死亡作用。推测这些依赖于ACSL的铁死亡调节作用需要将脂肪酸掺入膜结合(例如PL)的脂质中。上述这些研究发现已经确定ACSL酶家族对铁死亡至关重要,也表明将脂肪酸活化为CoA酯是铁死亡的关键调控步骤。

有些研究试图确定驱动铁死亡的特定膜脂类型。如上所述,ACSL4和LPCAT3作为铁死亡的关键驱动因子的发现表明,游离PUFA本身并不是铁死亡的驱动因素。与该结论一致的另一个最近的发现是,磷脂酶A2组VI(iPLA2b)通过从PL中去除氧化的PUFA尾部来抑制p53驱动的铁死亡。因此,氧化的PUFA尾部必须保留在膜结合的PL的环境中(即膜上),以促进铁死亡的发生;有趣的是,一旦从PL上切割下来,氧化的 PUFA 尾巴就不再驱动细胞死亡(图 2)。这突出表明氧化的PUFA对细胞没有内在毒性,但特定细胞膜内过氧化PUFA的过度积累是导致铁死亡的事件。iPLA2b(也称为PLA2G6)的失活或缺乏,与帕金森病(PD)和运动障碍有关,也与胎盘滋养细胞过度铁死亡从而导致胎儿发育不良的风险有关。因此,含氧化PUFA膜脂积累在至少两种疾病背景下会导致病理性铁死亡。所以不应将铁死亡的发生视为一种一般类型的氧化应激,而应将其视为发生于细胞膜的致命脂质过氧化物积累。

并非所有含PUFA的膜定位脂质都会导致铁死亡。2017的一项研究据报道,与其他 PL 相比,特定的PL,即具有一个花生四烯基(20:4)或一个肾上腺基(22:4)PUFA尾部的磷脂酰乙醇胺(PEs),与铁死亡的关系更紧密。尽管在本研究中通过LC-MS/MS可以检测到350种不同的 PL,包括130种含氧脂质,但那些有着PE头和20:4和 22:4酰基尾的PL与铁死亡的敏感性关联最强。

PL具有两个脂肪酰基尾,一个通常衍生自饱和脂肪酸,例如棕榈酸 (C16:0),另一个衍生自任何类型的脂肪酸,例如MUFA、PUFA或饱和脂肪酸。然而,可以检测到两个PUFA尾巴的不寻常PL与铁死亡高度相关。含有PUFA的醚脂(例如缩醛磷脂)也与铁死亡敏感性有关,2-花生四烯酸甘油也是。因此,几种具有PUFA尾巴的不同脂质有助于驱动铁死亡。此外,PUFA生物合成本身就是一种调节对铁死亡敏感性的手段:能量应激通过激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK),以及通过控制乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACC) 限制 PUFA 生物合成的作用,来抵抗铁死亡。总之,含PUFA且位于细胞膜的脂质是铁死亡的驱动因素,其中包括PL、醚脂质和其他甘油衍生的脂质。

ROS生物学

1、GPX4和谷胱甘肽抑制脂质ROS的积累

Erastin 和 RSL3 代表着前两类铁死亡诱导化合物(即一类和二类FIN,ferroptosis inducers),一类通过抑制系统xc-阻止胱氨酸的摄取,另一类通过抑制GPX4发挥作用(图 2)。同时,通过其他机制消耗GSH也可以使细胞对铁死亡敏感:多药耐药基因MDR1通过调控GSH 的产出来提高对铁死亡的敏感性;而cys分解代谢酶cys双加氧酶1(CDO1)通过消耗 cys 进而降低GSH 水平,调节细胞对铁死亡的敏感性。最近的一份报告表明,谷氨酸 (Glu)-cys连接酶(其催化亚基由Glu-cys连接酶催化亚基 [GCLC] 编码)不仅通过合成 GSH来抵抗铁死亡,还通过转化Glu为g-谷氨酰肽从而限制其水平来提升铁死亡抗性,这也表明 Glu 可以促进铁死亡。

GPX4的降解可以促进铁死亡,而GPX4的抑制不行。2016 年,我的实验室在半胱天冬酶无关致死(CIL)化合物的筛选中发现了一种新的铁死亡诱导化合物:Ferroptosis-Inducer-56(FIN56),它通过介导GPX4的降解发挥作用。筛选中最值得提到的化合物是CIL56。通过优化这种化合物分子骨架的周围结构,最终产生了一种选择性诱导铁死亡而不激活坏死的化合物,即FIN56。它不仅可以诱导GPX4的降解,还可以通过甲羟戊酸途径起作用:通过消耗辅酶Q10(CoQ10)来提高细胞对铁死亡的敏感性。其他控制 GPX4 降解的机制也参与调节对铁死亡的敏感性:例如,伴侣蛋白介导的自噬会诱导GPX4的降解并有助于铁死亡的发生。

2、不依赖于GPX4的脂质ROS积累调控方式

GPX4是一种铁死亡的中枢抑制因子。然而,在过去几年中,已经发现了三种不依赖 GPX4 的铁死亡抑制系统。它们分别为铁死亡抑制蛋白1(FSP1)/CoQ10、二氢乳清酸脱氢酶(DHODH) 和环GTP水解酶1(GCH1)/四氢生物蝶呤(BH4),通过独立于GPX4的方式来抑制铁死亡。1956 年,CoQ10首先在牛心脏中被纯化出来,由于其普遍的存在和类似维生素的结构,最初被称为维生素Q10或泛醌,在随后的几十年被证明在电子传递链中发挥至关重要的电子携带作用。虽然GPX4是抵抗脂质过氧化的主要防御者,CoQ10仍是防御铁死亡的脂质过氧化的第二种内源性机制。事实上,辅酶Q10存在于整个细胞的不同类型膜中,而不仅仅是线粒体中。

两个研究报告说,一种基因产物(以前称为AIFM2后更名为FSP1),通过消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH,是细胞还原能力的主要来源)来再生还原形式的辅酶Q10。还原的CoQ10清除脂质过氧化中间体而后被氧化。同时进一步的消耗NADPH以再生还原形式的辅酶Q10。事实上,NADPH被发现是预测NCI60癌细胞系对铁死亡抗性的生物标志物,据报道,细胞溶质磷酸酶MESH1通过其对NADPH丰度的影响来控制细胞对铁死亡的敏感性。

在2020年和2021年又报道了另外两个系统,它们不依赖GPX4,通过抑制脂质过氧化导致铁死亡。首先,在CRISPRa筛选中发现负责生产内源代谢物BH4的GCH1可以抑制铁死亡,这个基因同时在CRISPRi筛选中作为铁死亡的增强因素。GCH1的表达产物通过两个方面的机制抑制铁死亡:(1)GCH1产生亲脂性抗氧化剂BH4以防止脂质过氧化,其功能类似于CoQ10,(2)GCH1介导脂质膜环境的重塑从而增加还原CoQ10的丰度,同时消耗铁死亡的诱导因素PUFA-PL。其次,DHODH被确定为位于线粒体的铁死亡的抑制因子,类似于FSP1在线粒体外膜中的功能,通过还原线粒体的CoQ10发挥作用。GCH1或DHODH高表达的细胞表现出更强的铁死亡抵抗力,而低表达的细胞则对铁死亡更敏感。

最后,最近的一份研究表明,还有其他独立于GSH/GPX4、FSP1/DHODH/CoQ10和GCH1/BH4的铁死亡抑制机制。氨基酸氧化酶白细胞介素4诱导因子1(IL4i1)最初是在B细胞中作为响应IL-4诱导的基因而发现的,而它产生的代谢物In3Py,同时通过清除自由基、调节铁死亡相关抑制基因的机制来抑制铁死亡。其他内源性代谢物,可能通过抑制脂质过氧化所需的自由基中间体,或通过控制调节脂质过氧化的基因的表达,来类似地抑制铁死亡。

3、铁的调节:铁驱动的脂质过氧化

含有PUFA的膜脂过氧化是由促进Fenton反应的不稳定铁池(促进脂质过氧化)和以铁为辅助因子的酶,如花生四烯酸脂氧合酶(ALOX,能够引发脂质氢过氧化物的形成,这些脂质氢过氧化物是芬顿反应的底物)驱动。15-脂氧合酶可以与PE结合蛋白1(PEBP1)复合,将酶的底物从游离PUFA特异性地转换为膜PL的PUFA尾。此外,p53依赖的铁死亡需要12-脂氧合酶。(同时)细胞色素P450氧化还原酶(POR)也有助于铁死亡过程中的脂质过氧化,这表明几种以铁为辅助因子的酶具有促进导致铁死亡的脂质过氧化的能力(图2)。

通过铁自噬(ferritinophagy)控制铁蛋白的水平并进一步的调节游离铁的丰度能够调控细胞对铁死亡的敏感性,因为铁蛋白的的丰度能够决定不稳定铁池(labile iron pool)的大小。同样的,激酶共济失调毛细血管扩张症(ATM)通过调节铁蛋白水平来控制细胞对铁死亡的敏感性。其他控制细胞内游离铁水平的机制也能够影响细胞对铁死亡的敏感性:铁通过 FPN转运出胞或通过prominin-2(prom2)介导的含铁蛋白多泡体(MVB)输出;同时外泌体通过耗尽细胞中的不稳定铁池以及诱导脂质过氧化的能力,也可以驱动细胞对铁死亡的抵抗。

内过氧化物与铁的反应也会引发铁死亡。FINO2 为代表第四类FIN,由Keith Woerpel等人于2016年通过合成和分析一系列含1,2-二氧戊环的化合物发现,其诱导铁死亡的方式并不是抑制系统xc-、消耗GSH、直接抑制GPX4或诱导GPX4的降解。因此,FINO2代表了另一种诱导铁死亡的机制方法。FINO2将Fe(II)氧化为Fe(III),因而与其他诱导铁死亡的化合物相比,铁螯合剂更有效地抑制了其致死活性。FINO2处理的细胞检测到的氧化脂质的分布比erastin处理后更广泛,这表明FINO2与Fe(II)发生芬顿反应,产生直接引发脂质过氧化的烷氧基自由基。

另一种可能是FINO2通过氧化非血红素铁辅助因子结合并激活脂氧合酶或其他铁依赖性酶:脂氧合酶的活性形式铁是三价铁。据报道,其他内过氧化物也会诱导一定程度的铁死亡,例如青蒿素及其衍生物。因此,内过氧化物代表了铁死亡诱导化合物的一个来源,这些化合物的作用方式与erastin、RSL3和FIN56等化合物不同,它们会直接破坏能够缓冲脂质过氧化物的铁死亡防御机制。因此在某些情况下,内源性内过氧化物(如前列腺素)可能成为铁死亡的自然触发因素。

Fe(II)以不稳定铁池的形式存在于细胞中,与包括GSH在内的低分子量化合物结合。GSH的消耗不仅可以使GPX4失活,还可以为Fenton反应提供游离的Fe(II),促进脂质过氧化物的传播并最终导致铁死亡。此外,铁蛋白中的铁储存需要暂时性地形成GSH-铁复合物,该复合物通过伴侣多聚(rC)结合蛋白1(PCBP1)将铁传递给铁蛋白。因此,GSH的消耗促进了不稳定铁的可用性。然而,GSH耗竭对于铁死亡不是必需的,因为在没有GSH耗竭的情况下直接抑制或敲除Gpx4足以引发铁死亡。

4、整合了代谢、活性氧生物学和铁调控的抗铁死亡机制

其中至少三种抗铁死亡的主要机制已被确定——抗氧化调节剂NRF2、转硫途径以及mTOR。NRF2是抗氧化反应的主要调节因子,主要驱动抑制铁死亡的转录反应;NRF2介导的保护机制因细胞和组织环境而异——例如,在胰腺癌细胞中,NRF2通过激活抑制ALOX5的微粒体GSH S-转移酶1(MGST1)来抑制铁死亡。而在肝癌细胞中,NRF2通过调控铁蛋白来驱动对铁死亡的抵抗。

转硫途径通过从蛋氨酸代谢中产生半胱氨酸来增强对铁死亡的抗性,克服由系统xc-被抑制而产生的半胱氨酸饥饿。2016年对铁死亡抑制因子的siRNA筛选显示,敲低CARS(半胱氨酰-tRNA合成酶)能够最成功地使细胞对铁死亡敏感,它通过激活转硫途径抵抗erastin诱导的铁死亡。据报道,当在培养基中补充转硫途径代谢物同型半胱氨酸时,会增强细胞的铁死亡,而不介导对铁死亡抵抗。这表明同型半胱氨酸可以独立于作为半胱氨酸的来源发挥作用。

mTOR通路通过增加GPX4蛋白合成和增加甾醇反应元件结合蛋白(SREBP)介导的脂肪合成来来促进细胞对铁死亡的抵抗。因此,可以通过控制铁的稳态、活性氧的丰度和细胞代谢来产生铁死亡的抗性。

驱动铁死亡的细胞器

铁死亡是通过积累过氧化脂质来实现的。近年来,研究人员对这些不同亚细胞定位的含有氧化脂质的膜进行了探索,阐明了各种细胞器对铁死亡的贡献(图3)。

图3

1、质膜破裂是铁死亡的晚期事件

质膜的崩坏在铁死亡进展的末期发生,这在各种不同类型的细胞死亡中很常见。ESCRT III 复合物可修复质膜损伤并减缓因铁死亡导致的细胞死亡。此外,已显示铁死亡信号能够在细胞之间传播,同时这种传播不依赖于质膜的破裂。相反,铁死亡信号向邻近细胞的传播可能取决于具有完整质膜包被的氧化脂质的释放,比如通过胞外囊泡;释放的氧化脂质可能会引发邻近细胞的铁死亡。如上所述,FSP1通过还原定位于质膜的CoQ10发挥其铁死亡防御功能,因此认为质膜上的脂质过氧化是铁死亡进展的重要后期步骤。

2、内质网是铁死亡过程中脂质过氧化的重要部位

给药后使用受激拉曼散射(SRS)显微镜对铁死亡抑制剂,即带有炔标记的ferrostatin(一种铁死亡抑制剂)类似物的定位进行成像,结果显示这些化合物在溶酶体、线粒体和内质网(ER)中积累。然而,这些化合物在溶酶体和线粒体中的积累并不影响它们诱导铁死亡的能力,表明抑制ER中的脂质过氧化足以阻止铁死亡发生。而那些能够调控脂质过氧化来调节铁死亡的化合物主要定位于ER,表明ER是铁死亡过程中脂质过氧化的最关键部位(图3)。尽管 PUFA也可以定位于脂滴,但脂滴中PUFA的存在并不会导致铁死亡。

细胞中ER的体积大小可能是铁死亡敏感性的关键决定因素。与这个观点一致的是,研究观察到ER的粘度在铁死亡期间增加,这个现象可能是由于氧化PUFA-PL的聚集,并会导致ER膜变硬。

3、线粒体作为半胱氨酸饥饿诱导的铁死亡的引发者和放大器

几项研究表明,线粒体可以作为半胱氨酸饥饿和谷胱甘肽耗尽介导的铁死亡的引发者或放大器。例如,线粒体DHODH和线粒体CoQ10抑制以这种方式触发的铁死亡的能力突出了线粒体的这一功能。同时,抑制位于线粒体的电子传递链也可以减轻由cys饥饿引起的铁死亡,直接对线粒体功能进行耗竭的结果也是如此。电子传递链的作用可能是由于电子泄漏从而产生超氧化物和H2O2,然后它们与Fe(II)反应以驱动Fenton反应和脂质过氧化。

4、过氧化物酶体通过醚脂的过氧化作用驱动铁死亡

一项研究通过CRISPR筛选发现,涉及过氧化物酶体功能的基因能够调节铁死亡,提示过氧化物酶体醚脂质(例如缩醛磷脂)是铁死亡的驱动因素。虽然过氧化物酶体ROS在铁死亡过程中没有被直接检测到,但是过氧化物酶体中产生的H2O2可能会引发脂质过氧化,这一过程可能需要过氧化物酶体Fe(II)的参与。

5、溶酶体是铁的储存库,可以引发铁死亡

Ferrostatins在溶酶体中积累,但它们的溶酶体定位并不能帮助它们抑制由erastin或RSL3诱导的铁死亡。因此,在这种情况下,溶酶体通常不会导致铁死亡。然而,溶酶体是铁的储存库,具有潜在诱发铁死亡的能力。事实上,将FINO2型内过氧化物重新定位到溶酶体可以引发铁死亡,尽管仍然需要通过ER的参与(图3)。此外,溶酶体蛋白皂苷的敲除导致脂褐质积累,从而介导溶酶体铁和ROS的积累,以及随后的神经元铁死亡。

6、高尔基体应激可以促进铁死亡

在某些情况下,用brefeldin A等药物触发的高尔基体应激会引发铁死亡。此外,Tf受体蛋白1(TfR1)通过内体循环将细胞内定位从高尔基体的转移到质膜;这种重新定位可以作为不依赖于ROS的铁死亡标志物,还可以作为杀死细胞的开关,通过额外摄取负载铁的Tf来进一步增强铁死亡。

总之,内质网是驱动脂质过氧化的中心枢纽,而脂质过氧化以铁死亡的形式促进细胞死亡。这是合乎逻辑的,因为大量的脂质和多不饱和脂肪酸的代谢发生在ER中。然而,其他细胞器,如线粒体、溶酶体、过氧化物酶体和高尔基体,可以通过启动脂质过氧化或增强ROS的产生来启动铁死亡或增强细胞对铁死亡的敏感性。最终,脂质过氧化物扩散到质膜,它们在那里引发质膜的破裂(图3)。ROS和脂质过氧化物如何在细胞器之间运输并促进铁死亡很大程度上仍未得到探索。此外,脂质过氧化物最终如何破坏细胞膜并导致细胞死亡的机制仍然未知。尽管如此,我们知道在自然界中,由脂质过氧化驱动的铁死亡已在许多正常生理环境中被利用,如下一节所述。

铁死亡的生理学功能

当我们在2012年首次提出铁死亡这一概念时,我们就发现它与Glu的毒性有关,但是铁死亡是否参与正常的生理学过程尚不清楚——最近的数据表明,铁死亡确实涉及了许多生理过程。

寻找涉及铁死亡的生物过程,一个关键步骤是发现检测铁死亡的标记物(图5)。鉴于铁死亡是由铁依赖的脂质过氧化驱动的,因此在铁死亡期间检测这种脂质过氧化是必要的(图5)。此外,线粒体在铁死亡期间通常表现出萎缩、致密的形态(因此可以通过检测线粒体来判断铁死亡)。还可以检测特定的基因表达变化:例如铁死亡的细胞中TfR1 的上调及其重定位于质膜(图5)。通过使用这些标记,已经发现了这种古老的细胞死亡方式的许多自然生理功能。

图5

1、肿瘤抑制和免疫功能

许多肿瘤抑制因子通过诱导铁死亡发挥其部分肿瘤抑制功能(图4)。肿瘤最常突变的抑癌基因p53通过抑制溶质载体家族7成员11(SLC7A11,是编码系统xc组件的两个基因之一)的表达驱动癌细胞的铁死亡。p53还激活ALOX12,一个位于17p染色体的一个基因,该基因经常在肿瘤中丢失,来促进脂质过氧化。p53能够在叔丁基过氧化氢(脂质过氧化的引发剂)存在下介导ALOX12依赖性细胞死亡,该细胞死亡可被ferrostatin-1抑制并引起铁死亡标记基因Ptgs2的表达,表明这种细胞死亡是铁死亡的变体,虽然这种死亡方式对铁的依赖性仍有待检测。此外,在非洲裔人群中发现的密码子47(S47)处的p53变体改变了p53诱导细胞死亡和抑制肿瘤形成的能力。这种变异会导致GSH和CoA积累,以及铁的积累和感染风险增加,但对疟疾毒素hemozoin具有抗性,这或许可以解释其在疟疾感染高风险地区的选择性。

图4

在小鼠中敲除表观遗传调节因子MLL4(通常在皮肤的皮肤鳞状细胞癌中发生突变)能够导致皮肤癌前病变的发展。这些小鼠皮肤中MLL4的缺失驱动了的转录水平的铁死亡抑制,包括增加SLC7A11、GPX4和硬脂酰辅酶A去饱和酶 1(SCD1)的表达、降低促进铁死亡的脂氧合酶ALOX12、ALOX12B 和 ALOXE3的表达,这些基因的表达变化都增强了细胞对铁死亡的抵抗(图4)。同样地,泛素羧基末端水解酶(BAP1)和NFS1通过调节铁死亡调控网络发挥肿瘤抑制作用(图4)。

肿瘤细胞从细胞外环境摄取地PUFA会抑制肿瘤生长:与富含MUFA的饮食相比,富含PUFA的饮食会减缓小鼠HCT116异种移植肿瘤的生长。因此,饮食中的多不饱和脂肪酸可以通过这种机制自然地抑制肿瘤(图4)。另一方面,肿瘤微环境中的胆固醇会导致CD8+T细胞上的CD36表达增加,并导致这些细胞摄取PUFA并发生铁死亡。因此,过量的胆固醇积累可能会通过减少CD8+T细胞的肿瘤浸润来促进肿瘤形成(图4)。

据报道,CD8+ T细胞通过诱导肿瘤细胞的铁死亡发挥其抑制肿瘤的作用。这种诱导活性是由活化的CD8+T细胞分泌干扰素γ(IFNg)介导的,并以此通过下调SLC7A11导致肿瘤细胞的铁死亡。此外,IFNg还上调ACSL4,这有助于铁死亡底物PL-PUFA的合成。添加外源性AA(一种PUFA,上文有提及),连同IFNg的介导,足以诱导肿瘤的铁死亡。此外,在肿瘤微环境中检测到过量的AA,表明源自CD8+ T细胞的AA+IFNg可能是第一个确定的天然铁死亡触发因素(图4)。缺乏其他已知的铁死亡生理型诱导剂可能仅仅只是反映了我们知识的空白,也或许是在组织中引发铁死亡的后果是破坏性的,使铁死亡除肿瘤抑制之外别无用武之处。

暴露于感染或疫苗后的持久免疫反应需要生发中心衍生的成熟、高亲和力浆细胞和记忆B细胞。滤泡CD4+辅助T细胞(Tfh)促进产生这种持久的免疫B细胞反应。这些Tfh细胞的活性必须在正常条件下受到严格调节,以防止自身免疫或病原体的再次感染。Tfh细胞的数量受GPX4控制的细胞死亡调节,通过补充硒提高GPX4丰度可增加接种流感疫苗后的抗体反应。然而,其他一些研究表明补充硒的益处有限;因此需要进一步验证硒和GPX4在调节Tfh细胞数量中的作用。

2、发育和衰老

最近的一项研究报告了一种抗体(HNEJ-1)的产生,该抗体能够识别被脂质过氧化的终产物 4-羟基-2-壬烯醛(HNE)修饰的蛋白质,以此证明它可以识别铁死亡细胞。不同年龄的大鼠(从E9.5到2.5岁)中,许多组织和细胞中都表现出这种铁死亡标记,其中包括E13.5时的核红细胞;抑制铁死亡也导致红细胞去核的延迟。SAMP8小鼠品系中的铁死亡标志物也增加了,这种品系的小鼠会自然地表现出加速的衰老特征。因此,铁死亡可能与红细胞生成的正常过程以及许多器官的衰老过程有关(图4)。

铁死亡在衰老和发育中的作用横跨不同的界别和物种。例如,据报道,线虫C. elegans的衰老与铁水平的升高、GSH的消耗以及对铁死亡的敏感性的增加有关。铁死亡还与稻瘟病真菌病原体Magnaporthe Oryzae的发育性的细胞死亡有关,并被发现是其感染阶段所必需的。

涉及铁死亡的病理过程

除了上述涉及铁死亡的正常生理功能外,铁死亡还与许多病理过程有关。应该指出的是,触发铁死亡的特定细胞层面和分子层面的病理生理机制,以及触发铁死亡导致的病理后遗症的机制在许多情况下是未知的。

1、铁过载疾病

鉴于铁在驱动脂质过氧化中的关键作用,许多涉及铁过载的疾病与铁死亡有关也就不足为奇了。遗传性血色素沉着病是一种铁过载疾病,它是由调节铁代谢基因的遗传突变引起的。最近的一份研究说明,喂食高铁饮食的小鼠和具有遗传性血色素沉着症相关突变的小鼠会出现带有铁死亡标志的肝损伤,而这种情况可以通过施加ferrostatin-1抑制铁死亡来逆转;此外,即使在遗传性血色素沉着病模型的小鼠中,低铁饮食也能够逆转铁死亡标志物的产生。这些发现再次强调了饮食变化会影响组织细胞对铁死亡的敏感性。

脑损伤也和铁过载有关。可以通过注射FeCl3到大鼠的躯体感觉皮质导致癫痫发作和认知功能降低,从而模拟脑损伤。Ferrostatin-1挽救了这些由铁过载导致的影响,表明这种脑损伤模型涉及到过度的脂质过氧化和可能的铁死亡。

2、Sedaghatian 型脊柱干骺端发育不良 (SSMD)

SSMD是一种罕见的新生儿疾病,表现为严重的呼吸窘迫、干骺端软骨发育不良和其他发育问题。已经报道了四个SSMD相关的GPX4截断突变,这类突变与GPX4蛋白的完全丧失以及新生儿出生后不久的死亡有关。最近,发现了点突变丧失部分功能的GPX4(R152H),这种点突变会导致酶活性受损,但不会完全丧失功能。与上述SSMD相关的GPX4突变不同,尽管发育受到了影响,具有该突变体的新生儿仍可以生存(图3)。该突变还通过防止GPX4上的两个赖氨酸残基被泛素化以防止降解以此稳定GPX4蛋白。

3、器官损伤

在过去的十年中,已经报道了多种铁死亡在器官损伤期间被激活的模型。最近发现,5 μm 微塑料可诱导小鼠肝脏细胞的铁死亡,相同地,2.5 μm 颗粒物(PM2.5)可诱导小鼠肺细胞的铁死亡;还发现铁死亡会导致肾脏修复缺陷和炎性近端肾小管细胞的形成。此外,脓毒血症期间发生的血管渗漏可导致多个器官损伤,这与铁死亡相关基因表达、代谢组学变化和铁死亡特征的标志物有关。镰状细胞病导致的器官损伤,与红细胞的溶解以及血红素在血浆中的积累有关。据报道,镰状细胞病模型小鼠的血清血红素升高,铁死亡以及心肌病的心脏标志物也升高,而抑制铁死亡可以减轻标志物水平。其他涉及血红素渗漏到器官的疾病也可能涉及到铁死亡,而这可能是铁死亡病理性诱导的常见机制。

最近的一项研究报告说,多器官功能障碍综合征(MODS),在重症监护病房(ICU)的危重患者中很常见,也涉及铁死亡。176名危重成年患者血浆中游离铁和丙二醛(脂质过氧化的标志物)的水平与患者序贯器官衰竭评估(SOFA)评分呈正相关。此外,给小鼠服用硫酸铁会导致多器官损伤,并提高肾脏、肝脏、肌肉、心脏和血浆中的损伤标志物,而铁死亡抑制剂/因子(如维生素 E、GPX4)和捕获自由基的抗氧化剂(ferrostatin 类化合物),可减轻这种损伤。因此,抑制铁死亡可能是预防重症监护环境中患者发生多器官损伤的可行策略。

4、视网膜变性

视网膜色素上皮细胞在视网膜疾病(例如与年龄相关的黄斑变性)发展期间经历变性和死亡。普鲁士蓝纳米颗粒可以通过减少亚铁离子的可用性来抑制这些细胞的死亡,这表明其细胞死亡机制可能涉及铁死亡。当全反式视黄醛的清除机制受损时,感光细胞会发生死亡,而对铁死亡的抑制会阻止它们的死亡。因此,视网膜疾病可能涉及铁死亡的发生。

5、神经退行性疾病

大量研究表明铁死亡与多种神经退行性疾病有关,包括亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病(AD)、PD和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。最新的研究扩展了这些发现:GPX4在ALS患者和小鼠模型的已经坏死失去功能的脊髓中被耗尽;而G93A SOD1模型中GPX4的过表达可以延长脊髓神经的存活期并延迟疾病发作;而通过CuII(atsm)抑制铁死亡,是一种临床及临床前有效的 ALS 治疗方法。

Glu的毒性可能涉及铁死亡。2001年,引入了术语氧化性死亡(oxytosis)来描述因Glu引发的神经元中的氧化性细胞死亡,其中的机制涉及到蛋白质合成、真核翻译起始因子2亚基 1(eIF2a)、ROS产生、环磷酸鸟苷(cGMP)门控离子通道和钙流入,以及脂氧合酶和GSH耗竭。控制氧化性死亡的机制,与控制各种在细胞类型和组织中存在的铁死亡的机制有多大程度的重叠仍不清楚。

虽然两者都涉及系统xc-的抑制和GSH的消耗,但氧化性死亡涉及到的过量的钙流入、cGMP门控通道和eIF2a的参与,以及线粒体肿胀和DNA片段化等特征在铁死亡中未观察到。为了确定氧化性死亡和铁死亡之间的关系,需要一套明确的标志物、检测方法和试剂来诱导和抑制氧化性死亡和铁死亡,以便对这些细胞死亡模式之间的异同进行系统的平行比较;而这种平行比较对于其他细胞死亡模式也很有价值。因此,仍不清楚Glu 毒性在多大程度上涉及氧化性死亡、铁死亡和/或其他死亡机制。

6、传染性疾病

铁死亡与细胞对感染因子的反应有关。许多病毒能够影响宿主铁的代谢和转运、活性氧的产生和抗氧化防御系统。丙型肝炎是肝病的主要原因,丙型肝炎病毒复制受到宿主细胞中铁死亡的激活的限制,特别是在脂肪酸去饱和酶2(FADS2)的控制下的铁死亡。FADS2参与亚油酸(18:2)、α-亚麻酸(18:3)、AA(20:4)和二十二碳六烯酸 (22:6)等不饱和脂肪酸的合成。这些去饱和程度更高的多不饱和脂肪酸,通过其对过氧化反应的敏感性来促进细胞的铁死亡。使用RNAi敲除FADS2可增强丙型肝炎病毒(HCV)的复制,这与抑制铁死亡有利于HCV复制的结论一致。因此,在HCV感染的情况下,铁死亡能够抑制病毒复制。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARSCoV-2)可能在感染期间激活铁死亡。COVID-19患者的血清铁蛋白水平较高,表明器官组织暴露于一个更高水平的铁环境中。叙利亚金仓鼠感染 SARS-CoV-2会出现和人类相似的COVID-19的病征,例如急性肺损伤、炎症和低氧血症。在对该模型的研究中发现了铁死亡典型的脂质变化,以及铁死亡标志物TfR1的表达。然而在这个仓鼠模型中,还不清楚铁死亡是像HCV模型那样有助于限制感染,还是导致炎症,抑或是不导致显著后果的感染后副产物(图3)。

斑马鱼中的海分枝杆菌感染受到血红素加氧酶1(HMOX1,该酶可调节血红素和铁的可用性)的抑制,这一现象可通过施加铁死亡抑制剂ferrostatin-1逆转,这表明铁死亡促进了感染。与此一致的,被结核分枝杆菌(Mtb)感染的巨噬细胞会诱导铁死亡;同时,在小鼠中抑制铁死亡,Mtb的感染会受到限制。因此,铁死亡促进了Mtb的感染(图3)。

铜绿假单胞菌是常见于住院患者和囊性纤维化患者的感染菌。铜绿假单胞菌通过分泌脂氧合酶(pLoxA)诱导宿主肺组织细胞的铁死亡,这与较差的临床转归相关。与Mtb的情况一样,铁死亡也会增强铜绿假单胞菌的感染(图3)。

铁死亡诱导剂也可能适用于一些感染的协同治疗。例如,锥虫对由GPX4同源的锥虫还原蛋白丢失引起的铁死亡敏感。如果可以找到与宿主的GPX4相比足够的治疗空窗剂量,则锥虫还原蛋白抑制剂可能对治疗锥虫感染有效(图3)。

7、自身免疫病

研究人员已经在自身免疫性疾病模型中检测到铁死亡的激活。系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,在研究中发现与铁死亡在中性粒细胞中的激活有关。SLE患者的中性粒细胞计数较低,是因为SLE患者的血清能够通过由CaMKIV-CREMa介导的GPX4下调,诱发铁死亡,以此促进中性粒细胞的死亡。此外,特异性敲除中性粒细胞GPX4的小鼠具有SLE的特征。因此,中性粒细胞中铁死亡的激活可能通过释放自身抗原的形式,促进了自身免疫性疾病的发展。同样地,由15-脂氧合酶驱动的人气道上皮细胞中的铁死亡,与线粒体DNA的释放和随之而来的哮喘恶化有关。哮喘涉及免疫反应的过度激活,这可能由释放免疫原性线粒体DNA的气道上皮细胞发生铁死亡所触发或导致恶化。当铁死亡发生在中性粒细胞或气道上皮细胞中时,会导致免疫过度的激活,并进一步发展成自身免疫性疾病(图3)。

8、肿瘤发生

铁死亡作为一种肿瘤抑制机制发挥作用,因此铁死亡的丧失可以驱动肿瘤的发生。最近的研究发现,硒蛋白是癌症风险的预测因子,同时硒的丰度在肿瘤组织中升高,这表明GPX4的丰度和活性与肿瘤发生相关。因此,在某些情况下,使铁死亡更难被激活的遗传和环境因素可能会驱动肿瘤发生。

最后,淋巴环境可以保护侵袭性黑色素瘤细胞逃避铁死亡,从而增加肿瘤细胞的转移扩散。直接通过血道转移的肿瘤细胞会发生铁死亡,但由于淋巴环境内的高水平油酸(以及其他MUFA)水平的特性,通过淋巴系统的转移可以保护转移性肿瘤细胞逃避铁死亡。

9、对环境热应激的反应

随着持续的气候变化推动全球气温升高,热应激可能成为一个越来越普遍的农业问题。热应激已被证明会在许多生物体中诱导铁死亡,包括植物拟南芥和光合蓝细菌Synechocystis sp。

铁死亡的治疗应用

鉴于近来大量的研究表明上述多种疾病与铁死亡有关,因此可能可以通过调控铁死亡来治疗这些疾病。除了开发可以有效通过特定机制选择性调节铁死亡的化合物和生物制剂外,探索出更多用于检测铁死亡和其他细胞死亡方式的可靠工具也很重要。目前,检测脂质过氧化的丰度是识别铁死亡进展一种方法(图5);检测脂质过氧化的方法包括使用硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)测定法、通过LC-MS/MS直接检测异前列腺素或脂质过氧化产物、C11-BODIPY 荧光探针检测脂质氧化物水平、以及通过抗体检测脂质过氧化的产物或产物的加合物,例如抗HNE FerAb抗体、HNEJ-1抗体和抗丙二醛(MDA)加合物1F83抗体。

我的实验室最近的研究报告,Tf受体TfR1的丰度及其膜定位增加可以作为铁死亡的标志物,可以用新发现的3F3-FMA抗体以及其他抗TfR1抗体来检测。然后,我们发现TfR1染色结果可以与机器学习相结合,以区分经历铁死亡的细胞和经历凋亡的细胞。CHAC1、PTGS2、SLC7A11和ACSL4等几个基因在铁死亡发生的过程中上调,而RGS4在铁死亡过程中被下调;这些基因的表达改变可以通过 qPCR 检测并作为铁死亡的指标(图5)。

尽管这些标志物将铁死亡与细胞凋亡以及程序性坏死区分开来,某些应激条件仍可以激活其中一些标志物而不激活铁死亡(图5)。因此,检测多个标志物对于明确识别铁死亡很重要——而脂质过氧化和TfR1动员的标志物是检测铁死亡的潜在手段,这同时还能排除其他的应激条件。尽管如此,伴随着学界对铁死亡及其与相关生物过程关系的理解加深,检测铁死亡的明确标准仍在不断发展。

1、铁死亡诱导剂

作为一种细胞死亡方式,铁死亡可以潜在地用于消除存在问题的细胞类型,例如癌细胞、炎症细胞或活化的成纤维细胞。确定适合诱导铁死亡的细胞类型,以及确定每种特定诱导机制是否也会诱导其他类型细胞铁死亡,是至关重要的。

已经确定了四种诱导铁死亡的机制:(1)抑制系统xc-(I型FIN),(2)抑制/降解/失活GPX4(II型FIN),(3)消耗还原型辅酶Q10(III型FIN),和(4)通过过氧化物、铁或多不饱和脂肪酸过载的方式诱导脂质过氧化(IV型FIN)。

几条证据表明抑制系统xc-是诱导铁死亡的有效机制——这种逆向转运蛋白有着多种结构不同的小分子抑制剂,如erastin、柳氮磺胺吡啶和Glu,它们通过抑制系统xc-并因此诱导铁死亡(图2);此外,系统xc-的底物胞外胱氨酸耗竭也能够直接导致铁死亡。类似地,GPX4的基因失活或小分子介导的抑制或降解会在许多细胞类型中诱导铁死亡。通过甲羟戊酸途径抑制CoQ10的生物合成或使CoQ10的还原酶(如AIFM2/FSP1或DHODH)失活,能够在不存在GPX4的环境中诱导铁死亡。最后,用过量的铁、PUFA或过氧化物(如tBOOH或FINO2)处理会诱导细胞的铁死亡。与其他细胞死亡机制相比,所有这四种机制对于铁死亡的诱导都具有相当的特异性,因为它们的致死作用大部分或完全被铁死亡特异性抑制剂抑制,同时其他细胞死亡类型的标志物没有被激活。

在许多情况(例如传染病和纤维化)下,铁死亡诱导剂可能是有益的。而铁死亡诱导剂研究最多的应用是消除各种类型的癌细胞。铁死亡诱导剂,例如GPX4抑制剂和系统xc-抑制剂,已显示出临床应用前景。例如,在治疗特定的肿瘤类型方面:弥漫性大B细胞淋巴瘤的异种移植瘤对系统xc-抑制剂咪唑酮埃拉汀(IKE)的治疗很敏感,同时它上调了异种移植肿瘤中的铁死亡标志物。在小鼠遗传型胰腺癌模型中敲除SLC7A11提供了显著的预防益处,而不会诱导除铁死亡以外的其他类型细胞死亡的标志物产生。

除了GPX4和系统xc-之外,还有其他靶点可用于诱导肿瘤细胞中的铁死亡。胰腺癌细胞的铁死亡抗性还依赖于天冬氨酸氨基转氨酶GOT1,而GOT1的敲低会使细胞对铁死亡敏感。此外,肺肿瘤的球状培养模型的生存依赖于NRF2对铁死亡的抑制。

除了在淋巴瘤和胰腺癌等特定肿瘤环境中的应用外,铁死亡诱导剂在放射治疗和免疫治疗方面同样有益。辐射可诱导癌细胞的铁死亡,而铁死亡的诱导剂可单独或与免疫疗法联合用作放射增敏剂。发生上皮-间质转化的侵袭性癌症更容易发生铁死亡,而对诱导细胞凋亡的化疗药物的抗性与对铁死亡敏感性的增加有关。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的扩增是其中一种将药物敏感性从 BRAF 转移到铁死亡的一种机制。

使用预测性生物标志物有助于确定特定环境的铁死亡诱导剂的有效性。据报道,许多生物标志物可用于筛选可能对铁死亡诱导的抗癌疗法产生最佳反应的患者,例如低水平的转硫代谢物、低水平的NADPH、对光动力诱导脂质过氧化的敏感性、PI3K/mTOR通路活性缺失、Hippo/YAP通路突变、PUFA生物合成基因ELOVL5和FADS1的表达水平、MDM2/MDMX通路的扩增以及癌细胞的透明细胞形态。总之,研究人员正在探索铁死亡诱导剂消除特定细胞群(例如特定肿瘤类型)的能力,这同时需要进一步的临床前研究来验证这一概念。

2、铁死亡的抑制剂

有几个关键的调控点可以有效和选择性地抑制铁死亡。铁死亡的过程是由特定脂质的过氧化驱动的,直接阻断这种过氧化过程是关键的调控点。通过补充硒上调GPX4丰度是干预铁死亡的间接手段。通过控制铁死亡脂质底物的生成以及ACSL4是另一种调控点;控制铁的可用性是第三种调控点。

在铁死亡被发现的早期,就已经发现了这种死亡方式的第一类抑制剂的几种潜在用途:发现ferrostatin-1和liproxstatin作为活性氧自由基的捕获剂来抑制脂质过氧化的传播,并在以下模型中有效:Glu 毒性模型 、HD、室性早发性白质软化、肾损伤和肝损伤。

除了ferrostatins和liproxstatins之外,还发现了其他铁死亡抑制剂。据报道,降胆固醇药物普罗布考及其类似物可抑制铁死亡并在Glu毒性模型中发挥功效。值得注意的是,necrostatin-1(nec-1)是一种抑制坏死性凋亡的RIPK1抑制剂,在高浓度下具有能够抑制铁死亡的脱靶效应,因此必须谨慎使用。给予硒可抑制中风期间的铁死亡。此外,线粒体靶向氮氧化物XJB-5-131可抑制细胞凋亡和铁死亡,是创伤性脑损伤和HD模型的有效治疗方法。

3、通过饮食控制铁死亡

许多研究表明,饮食因素可以促进或抑制铁死亡。例如,摄入过多的多不饱和脂肪酸会促进发生在秀丽隐杆线虫的铁死亡。而膳食维生素E可以缓解GPX4缺失带来的影响。如上所述,摄入硒和铁的水平也会影响对机体铁死亡的敏感性。这些发现表明,模式生物的饮食可能是影响铁死亡敏感性的重要变量,应谨慎控制。此外,有可能创造优化的饮食方案来控制动物和人类的铁死亡。

结论和未来方向

总结上述研究的意义,理解铁死亡的六个关键方面对于充分了解这种细胞死亡形式的调控机制有着重要意义(图6)。

图6

第一,铁死亡并不是ROS普遍性生成的同义词;事实上,有可能在没有铁死亡的情况下产生ROS,并且铁死亡通常涉及特定脂质的氧化,而不是ROS的普遍性积累。

第二,需要寻找在各种情况下促进铁死亡的特定脂质。显而易见的,被氧化的脂质具有不同的促进铁死亡的能力,而另一些脂质,如MUFA,能够抑制铁死亡。

第三,铁还有除了诱导铁死亡之外的许多作用,因此铁的积累并不等同于铁死亡。此外,铁的氧化状态对其促进铁死亡的能力很重要——Fe(II)促进铁死亡,而Fe(III)除了以活性形式存在于脂氧合酶的活性位点外,通常是惰性的,并储存在铁蛋白中。因此,确定铁的氧化还原状态以及每种状态是否在特定情况下对铁死亡有特殊贡献是很重要的。

第四,铁死亡在多大程度上属于坏死性死亡仍不确定;铁死亡与细胞凋亡、细胞焦亡、程序性坏死和不受调节的坏死明显不同。然而,铁死亡是否可以归类为坏死性死亡的一种,需要坏死性死亡这一术语得到更好的定义并且明确其相关功能。

第五,铁死亡在不同情况下与炎症和/或免疫原性的关联程度仍不清楚。许多研究表明,铁死亡会导致炎症并具有免疫原性,但铁死亡在这方面的普遍性及其与细胞焦亡、坏死性凋亡或细胞凋亡在免疫相关作用方面的比较仍不明了。

最后,新陈代谢、铁代谢的调控和ROS防御系统共同控制细胞对铁死亡的敏感性。因此,扰乱新陈代谢、铁的稳态和活性氧水平,是调节细胞对铁死亡敏感性的关键手段。铁死亡领域正在迅速地加速发展,部分得益于新陈代谢、铁调控和ROS生物学这三个领域的新见解、发现和方法的交叉融合的协同作用。从这三个领域,都可以深入了解铁死亡的不同方面——新陈代谢解释了铁死亡的关键底物是如何产生和重塑的;铁的调控揭示了如何控制Fe(II)的可用性;而ROS生物学揭示了针对脂质过氧化的内源性防御如何发挥作用(图6)。

尽管如此,我们对铁死亡的理解仍然不完整。至少有三个未解决的关键问题可能会在未来十年推动铁死亡的进展。

一、铁死亡的执行机制是什么?如上所述,铁死亡是由特定细胞器(例如ER)中特定的含PUFA脂质的过氧化作用驱动的。这导致细胞死亡的方式、位置和时间本身是未知的。

二、确定铁死亡的不同触发因素将阐明这种细胞死亡形式在生理和病理水平发生的机制和背景。显而易见的,Glu、铁的过载、SLC7A11的抑制、GPX4的耗竭和PUFA的摄取可以作为铁死亡的触发因素。定义铁死亡的全部触发因素及其发生的环境将极大地丰富我们从生物学和医学角度对铁死亡的理解。

三、选择性调控铁死亡的机制和方法仍然难以捉摸。这种在特定组织、细胞和/或疾病环境中的选择性激活或抑制对将铁死亡的基础知识转化为治疗方法至关重要。例如,系统性地靶向GPX4可能会导致毒性,例如肾损伤和神经毒性,或其他器官损伤。然而,选择性靶向持久性肿瘤细胞的方法具有影响力,并可能提供一个治疗安全窗口。有多种方法,例如通过药物递送载体、优化其生物学分布和药代动力学、以及对靶点和机制的选择能够提高不同情况下对铁死亡的特异性调节。阐明这些机制和策略可能对于利用铁死亡的基础知识来获得治疗上的收益至关重要。解决这些悬而未决的问题,不仅仅是在铁死亡领域,还会在日益多样化的生物学领域产生一些重要的新见解。

作者:Mars

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