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结构解析和修正流程

已有 39641 次阅读 2010-6-5 11:20 |个人分类:未分类|系统分类:科研笔记| 蛋白结构, coot, 修正流程, phenix、, ccp4

以下是我总结的晶体结构解析方法:
I 分子置换法
 
使用condition:目标蛋白A有同源蛋白结构B,同源性30%以上。
 
用到的软件及程序: HKL2000, CCP4, COOT, Phenix, CNS,
 
解析过程: 收集数据(X-RAY)--> hkl2000 处理数据--> 置换前数据处理分子置换(ccp4 Molecular Replacement--MR) -->COOT手工修正,氨基酸序列调换 -->phenix refine--coot 手工修正 phenix refine。。。__拉氏构象图上outlier为0为之,且R-free,R-work达到足够低的值。 -->phenix  加水refine(溶剂平滑)。。。(若修正过程中有bias 最好也用CNS修正一下)
 
II 同晶置换法--硒代蛋白
 
使用condition: 目标蛋白没有同源结构。
 
用到的软件及程序:HKL2000, CCP4, COOT, Phenix, CNS,
 
解析过程:收集数据(X-ray 硒代蛋白及母体蛋白)--> hkl2000处理数据 -->ccp4 程序包搜索搜索硒信号(gap),相位确定 -->搭模 --->以硒代数据得到的pdb为模型和母体高分辨数据得到的mtz进行分子置换--> 后面修正过程与分子置换相似。
 
 各步骤介绍:
 
I .hkl2000:将x-ray 收集的图像编译转化为数字信息,得到的关键文件有.sca和.log ,log文件会给出hkl2000 处理的过程记录,sca文件是最终处理的输出文件。sca文件包含晶体的空间群等信息。带有可以被转化为电子密度图的信息。评价hkl2000处理是否成功的参数有数据完整度,最高分辨率等,一般希望处理出在完整度允许的情况下最高分辨率的数据。
 
分子置换前处理:ccp4 软件包
 
a. data reduction,即将sca文件转换为mtz文件。 用imported integrated data。
 
b. cell content analysis 这个是晶体中蛋白聚集体数的分析, 通过分析晶体含水量得到一个晶胞内的蛋白分子数。用mtz文件进行。含水量在40%-60%之间时对应得n即为正确值。这个聚集体数会在mr中使用。
 
II. model 选取:进行分子置换的model为已知的同源蛋白结构或硒代得到的pdb,对model的要求是越接近球形越好。一般用单体。从pdb库中下载了pdb后可以用vim编辑,选取自己想要的那一段做model。
 
III. 分子置换:ccp4 软件包
 
 MR 以选取好的model.pdb为模板,对mtz文件进行分子置换,这时要修改的程序参数为在晶体中寻找的model的个数,及分子量,model的个数通过N值来计算,如果model为单体的话,model个数即为n值。 MR之后会得到一个pdb,一个mtz(电子密度图)。
 
IV.修正:
 
COOT 修正:在coot中同时打开pdb和mtz,手工用命令将pdb残基突变为自己氨基酸的序列,并将氨基酸残基放入密度中。
 
phenix 修正: 命令 phenix.refine protein.sca protein.pdb
 
修正完成后会得到 一个protein—refine.pdb, 一个 protein_refine.coeff.mtz, 一个data.mtz。 其中pdb文件即为目标pdb,coeff.mtz为相应的电子密度图,data.mtz在第二轮coot手工修正后再phenix的时候代替sca的位置。
 
phenix加水 溶剂平滑修正
 
对于结构质量的评价标准:
 
拉氏构象图:outlier的数量要为0~( coot中看到)
 
R-work 和R-free 的值,越低越好~(这个参数可以在phenix之后的.sol 文件中看到)
总结:HKL2000-->.sca-->data reduction-->.mtz--> cell content analysis(n)-->MR--> .pdb, .mtz-->coot mutation--> phenix1(--pick out good chain-->MR2 --> phenix2 )--> coot-->phenix......(CNS)...... phenix+water.....
*()中是我根据自己的修正加上去的,仅供参考
硒代相位的确定以后再补吧~ 太长了
 
目前我的修正就走到这里,之后的具体步骤再续喽~ ^_^
 
 
 
 
 
 
 
 
 


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