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科研助攻丨重组蛋白,看这篇就够了!- MecChemExpress

已有 779 次阅读 2022-10-24 14:05 |系统分类:科研笔记

Part 1:产品选择

:我要买 Human EGF 用于体外细胞培养,网上一查,好多种相似产品,我该如何选择?
:重组蛋白选择,有几个重点选择标准,我给你们列出来了!



图 1. 重组蛋白表达步骤


选择因素 1:研究目的
在选择产品前,明确实验目的,可排除一些干扰因素。




图 2. 重组蛋白表达体系的选择和对比


选择因素 2:产品特性


活性数据 (Biological Activity)

ED50 半数有效量 (Median effective dose, ED50) 在量反应中指能引起 50% 最大反应强度的药量,在质反应中指引起 50% 实验对象出现阳性反应时的药量。一般是通过其在标准化条件下对特定细胞类型的影响 (例如刺激细胞增殖) 来测量的。


小贴士:如何将 ED50 转换为比活力单位?
: 如下图中,通过Human EGF 剂量依赖性刺激小鼠 BALB/c 3T3细胞增殖,ED50 <0.2 ng/mL。



一个活性单位是每毫升具有最大响应作用 50% 的细胞因子的数量:

Human EGF 1 个 unit (1U) 就是 0.2 ng/mL,每 1 mg 的 Human EGF 的活力值 (unit) 为:



即 Human EGF 的比活力为 5.0 × 106 units/mg。

计算当然也是有捷径的:

进入公众号 MCE 抑制剂-重组蛋白复溶计算器-比活力计算器





Part 2:老生常谈—重组蛋白复溶及保存
:由于工艺原因,蛋白冻干粉产品会呈现粉末状或肉眼不易观察到的透明薄膜状、胶冻状、雪花状,这些都是正常现象。冻干的体积大小也会受冻干前缓冲液组分、盐离子浓度、产品浓度等影响。此外,在运输过程中,冻干颗粒可能会分散,并粘附于瓶壁和瓶盖。

MCE 保证每管产品的蛋白总量达到标示含量。说到这里,讲讲怎么更好地溶解重组蛋白吧~



第一步:开盖前需离心


在开盖使用之前,需先离心,将冻干粉收集于管底。实验操作: 10,000-12,000 rpm 离心 30 s,若没有高速离心机,3000-3500 rpm,离心 5 mins。
第二步:产品复溶


还是以 Human EGF 为案例;10 μg 规格溶解

敲黑板:无论长期实验还是短期实验,溶解的浓度不低于 100 μg/mL!!



短期实验:使用复溶 Buffer 直接溶解的重组蛋白,液体可在 2-8℃ 最长保存 1 周。对于周期较短的实验 (不超过 7 天),可以直接取该条件下保存的细胞因子或者重组蛋白溶液加入到培养体系内即可,一周之内用完。
(复溶 Buffer: 可参考重组蛋白使用指里建议的溶液或者使用已贴心搭配好的蛋白伴侣)
长期实验:以下步骤供参考:
1、先加 20-30 μL 建议复溶液




2、再加 70-80 μL 含载体蛋白 (0.1% BSA, 5% HAS, 10% FBS, 或 5% 海藻糖) 的缓冲液/培养基


3、分装大于 20 μL/管


第三步:产品保存


用复溶 Buffer 重悬的蛋白溶液用含载体蛋白 (0.1% BSA, 5% HAS, 10% FBS, 5% 海藻糖) 的溶液稀释后,-20℃ 可保存至少三个月。




Part 3:产品细节篇


:以下一些小细节也要注意。



1、溶解过程中不要采用涡旋震荡辅助溶解


上期给大家说到:化合物的溶解可以借助水浴、超声、涡旋、震荡等方法助溶。但对于重组蛋白来说,具备一定的空间结构会使其活性更佳。

正确操作:移液器枪头轻轻吹打混匀或者上下颠倒混匀。若无法做到充分溶解,可以将复溶产品至于水平摇床低速摇一段时间或 4℃ 静置 2 h 以上。




2、稀释用的含载体蛋白的溶液选择


特别注意的是,稀释用的含载体蛋白的溶液是有一定缓冲能力、pH 值为中性的溶液,如 PBS、培养液 DMEM 或者 RPMI1640 等。不可直接用水来代替。



3、不同重组蛋白之间是否可以交叉使用?
重组蛋白的种属交叉活性需要根据具体产品而定;建议尽量选择对应种属。如实在无法匹配种属:
a . 大多数人细胞因子对小鼠细胞有效 (仅少数例外)。
b. 干扰素,GM-CSF,IL-3,IL-4 具有种属特异性,例如重组人的这些细胞因子只能作用于人细胞,对小鼠和大鼠等其他种属无效果。
c. 成纤维细胞生长因子 (FGFs)、神经营养素 (Neurotrophins,如 BDNGF/GDNF/CNTF/β-NGF 等)、TGF-β  等高度保守,各种属间交叉活性强。
d. 同源交叉性的比对:打开蛋白数据库网站 Uniport,进行数据比对。
以上信息仅供参考,毕竟文献是最好的老师




4、有些蛋白带了标签,有什么作用?


重组蛋白的融合标签是在目的蛋白 N 端或 C 端进行融合表达的特定蛋白、多肽或寡肽标签。常用的标签有 His、GST、MBP、Trx、TF、MBP、Nus、SUMO、Flag 和 Fc 等。





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