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外泌体介绍 - MedChemExpress

已有 741 次阅读 2022-10-21 13:41 |系统分类:科研笔记

走近外泌体

此前,小 M 已经给大家介绍过外泌体了,它是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小囊泡,广泛存在于血液、唾液、尿液及乳汁等体液中,具有细胞信使功能,参与细胞通讯。


1. 细胞外囊泡分类[1]

外泌体是目前为止定义最为明确的细胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs),其生成过程、释放途径、大小及功能区别于微囊泡 (Microvesicles) 和凋亡小体 (Apoptosis bodies)。


表 1. 外泌体、微囊泡和凋亡小体的区别


外泌体最早于 1983 年发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中;2013 年,三位国际科学家因 “发现并阐释细胞囊泡运输系统及其调控机制”,获得诺贝尔生理学或医学奖。


近几年,外泌体更是成为科研宠儿,几乎所有疾病领域都有它的身影:由于其广泛存在于各种体液中,便于获取和检测,具有疾病诊断和预后检测的应用潜力;当外泌体与靶向蛋白等一起进行基因工程编辑,是优选的治疗药物的递送方案 (生物相容性更好,低免疫原性)。


今年 6 月 4 日,Nature biomedical engineering 报道了程柯教授团队 Exosomes decorated with a recombinant SARS-CoV-2 receptor-binding domain as an inhalable COVID-19 vaccine 一文。该文介绍了构建的 SARS-CoV-2 的 RBD 抗原修饰的人源肺球细胞外泌体,作为可雾化吸入的 COVID-19 疫苗 (RBD-Exo 疫苗),RBD-Exo 疫苗经冻干后在室温下稳定 3 个月以上。并且由于外泌体的强同源靶向能力,RBD-Exo 疫苗被雾化吸入后在呼吸道及肺组织表现出更长驻留时间,在动物实验中,两剂 RBD-Exo 疫苗可减弱重症肺炎,并减少 SARS-CoV-2 活病毒感染后的炎症浸润。


图 2. RBD-Exo 疫苗制备示意图[2]

通过吸入进入肺部。RBD-Exo 诱导仓鼠产生抗 SARS-CoV-2 感染的 RBD 特异性 IgA 和 IgG 抗体,产生黏膜免疫和全身免疫。


外泌体提取与纯化

总之,外泌体研究正如火如荼,想要研究好外泌体,首要任务就是获得高纯度的外泌体,小 M 带大家一起看下常见的提取方法及各自优缺点吧~


2. 不同外泌体提取方法优缺点


外泌体提取试剂盒,让高纯度外泌体获得更 Easy!


图 3. 外泌体提取步骤


以上方法都可以对外泌体进行富集和纯化,大家可以根据需求选择合适的提取方法,总有一款适合你哦~

对于外泌体的标记和鉴定

获得外泌体之后,如何对其进行鉴定又是一个困扰研究者的问题。国际细胞外囊泡学会 (ISEV) 在 2014 年提议,对于分离获得的外泌体需要从三个层面进行鉴定:

WB 检测外泌体标志蛋白表达情况

外泌体膜上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白家族 (CD63/CD81/CD9)、热休克蛋白家族 (HSP60/HSP70/HSPA5/CCT2/HSP90) 和一些细胞特异性蛋白。其中 CD63/ TSG101 是最常用到的外泌体标志物。


TEM 鉴定外泌体形态

电镜具有较高的分辨率,可以直接观察到样品中外泌体的形态。


NTA 检测外泌体粒径及浓度

TEM 可以观察外泌体的形态学特征,但无法体现样本中所有外泌体的粒径分布情况及整体浓度。NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) 技术可快速精准地分析外泌体的粒径分布及浓度,为外泌体鉴定提供有力证据。


上实例

Muyu Yu 等人在研究经阿伐他汀预处理后的骨髓间充质干细胞 (BMSC) 外泌体是否具有促血管生成能力时,对 BMSC 来源的外泌体进行了鉴定,如图 4 所示:透射电镜观察到各组外泌体典型的球形、膜状结构。WB 分析显示,分离的颗粒中均检测到外泌体标志蛋白 TSG101 和 CD81。NTA 结果表明,Exos 和 ATV-Exos 均在大约 80-120 nm 处显示单峰。


图 4. BMSC 来源的外泌体的鉴定[3]



对外泌体的标记示踪

在对外泌体的探索中,对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪,更助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的标记和鉴定方法较多,主要包括亲脂性染料和膜渗透型化合物等。


01 亲脂类染料示踪

亲脂类染料 (DiO, DiI, DiD, DiR) 可以很好的对外泌体进行标记,也是外泌体研究中的常用染料


体外示踪:如下图 5,Exos 和 ATV-Exos 外泌体用 PKH26 红色荧光标记,细胞骨架和细胞核分别用鬼笔环肽和 DAPI 标记,激光共聚焦显微镜扫描结果表明:PKH26 标记的外泌体 (红) 定位于 HUVEC 细胞核周区域,证实了外泌体被内化。


图 5. HUVEC 对 Exos 和 ATV-Exos 的摄取验证[3]


体内示踪:

图 6. DIR 标记 4T1 外泌体在小鼠乳腺中的体内成像图[4]

向有 4T1 肿瘤的Balb/c小鼠静脉注射4T1外泌体。外泌体用亲脂性荧光探针 DIR 标记;在每幅图像的右侧给出了亮度效率的刻度。

02 膜渗透型化物示踪

膜渗透型化合物 CFSE 也是一种亲脂类荧光染料,可被动扩散进入细胞。其本身无颜色,进入细胞后脱去醋酸盐基团,生成羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (绿色荧光),也常用来对外泌体进行有效示踪。


图 7. CFSE 标记胚胎组织外泌体共聚焦图像[5]

看了这么多,相信大家对外泌体有了更深的认识。MCE 现已推出外泌体相关产品,心动不如行动,来 MCE 官网查询具体的产品信息吧!

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参考文献

1. Naveed Akbar, Valerio Azzimato, Robin P Choudhury, Myriam Aouadi, et al. Extracellular vesicles in metabolic disease. Diabetologia. 2019 Dec;62(12): 2179-2187.

2. Zhenzhen Wang, Kristen D Popowski, et al. Exosomes decorated with a recombinant SARS-CoV-2 receptor-binding domain as an inhalable COVID-19 vaccine. Nat Biomed Eng. 2022 Jul 4


3. Muyu Yu, Wei Liu, Junxian Li, et al. Exosomes derived from atorvastatin-pretreated MSC accelerate diabetic wound repair by enhancing angiogenesis via AKT/eNOS pathway. Stem Cell Res Ther. 2020 Aug 12;11(1):350.


4. Tyson Smyth, Max Kullberg, et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. J Control Release. 2015 Feb 10; 199: 145-55.


5. Samantha Sheller-Miller, Jayshil Trivedi, et al. Exosomes Cause Preterm Birth in Mice: Evidence for Paracrine Signaling in Pregnancy. Sci Rep. 2019 Jan 24;9(1):608




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