受体相互作用蛋白1（RIP1）激酶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其 C 端含死亡结构域，通过自身相互结合或与其它含死亡结构域的分子（如 TRADD、Fas、TNFRI）结合，参与 TNF、FasL 刺激后的信号转导，介导 NF-κB 活化，并诱导细胞凋亡，其功能受泛素化、锌指蛋白及热休克蛋白等的调节。研究表明^[1,2]，RIP1 激酶的活化与缺血性损伤、炎症性疾病、神经退行性疾病密切相关。Yoshikawa 等^[3]，以 RIP1 为靶点，设计 RIP1 激酶抑制剂用于治疗自身免疫性脑脊髓炎等神经退行性疾病。

Yoshikawa 等，首先构建了 TR-FRET 体外筛选平台，然后运用该方法对课题组已有的化合物库进行筛选，发现了苯并咪唑衍生物 10，其 pKi 值为 7.20。随后将其与已报道的 RIP1 抑制剂 6 进行分子融合，设计了化合物 11，其拥有全新的母核结构和中等活性的 RIP1 抑制活性。研究表明，化合物 6 可以被 p 糖蛋白外排，进而导致较差的血脑屏障通透性。但是，化合物 11 却拥有较低的p 糖蛋白外排率，这也许是因为其极性表面积减小，氢键供体数量减少的原因。随后以 11 为先导化合物对母核进行替换，期望能够在保持其优异理化性质的同时，提高化合物的活性（图1）。经过一系列的结构改造，结果如图 2 所示，化合物 14 拥有最强的活性（pKi＝8.41）和 较低的 p 糖蛋白外排率（ER=0.7）。

图 1. 化合物 6、10 和 11 的结构式（图片来源：《J.Med. Chem.》）

图2. 化合物母核的改造（图片来源：《J.Med. Chem.》）

为了更好的研究化合物 14 与靶蛋白的作用模式，研究人员进行了分子对接，结果如图 3 所示。根据对接结果进行结构改造：1）分子中的苄基伸入疏水变构调节口袋，该口袋位于 ATP 结合口袋的背面，主要由亲脂性氨基酸残基 Leu129 和 Val134 的侧链组成，因此可以在苯环上引入合适的取代基来探讨活性的变化，也可以在苯环上增加与 Ser161 的氢键相互作用（R1）；2）吡唑环的 3 位周围存在一个较小的疏水口袋，在该处引入取代基来探讨口袋的大小（R2）；3）通过在化合物左侧苯环的间位和对位引入取代基（R3）改善化合物的 ADMET 性质。经过一系列的结构优化，作者得到了候选化合物 22，其 pKi 值为 9.04，ER 值为 0.6，在人和小鼠肝微粒体中的清除率均小于 1 μL/min/mg，小鼠口服生物利用度为 52.2%。晶体结构复合物也阐明了其与靶蛋白的确切作用模式。（图4）

图 3.（A－B）化合物 14 与 RIP1 蛋白的分子对接图；（C）化合物的设计及化合物 22 的分子结构式（图片来源：《J.Med. Chem.》）

图 4.化合物 22 与 RIP1 蛋白的共晶复合物（图片来源：《J. Med. Chem.》）

鉴于化合物 22 优异的体外活性和药代动力学性质，随后进行体内药效实验。口服给药 26 天，每天监测实验性变态反应性脑脊髓炎模型（EAE）小鼠的临床症状。空白对照组小鼠在第 12 天开始出现 EAE 临床症状，并在 21 天左右达到顶峰；与之对应的给药组可以减弱 EAE 临床症状。这一结果表明，化合物 22 可以预防 EAE 模型的疾病进展。（图5）

图 5. 评价化合物 22 在 EAE 模型中的效果

小M 的小思考：

RIP1 作为细胞凋亡的关键调节蛋白，自从其被发现以来就备受关注。其不仅参与促细胞存活的信号传导，还参与多种途径的细胞程序性死亡信号传导，与多种疾病如癌症、神经退行性疾病、自身免疫性疾病密切相关。该靶点的抑制剂 GSK2982772 目前正在进行炎症性疾病的临床研究，如溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病等。然而，针对神经退行性疾病尚未有抑制剂进入临床研究，其原因主要是因为抑制剂较低的口服生物利用度和较差的脑通透性。本研究通过高通量筛选和基于结构的药物设计，发现了活性高、药代动力学性质优、p 糖蛋白外排率低的新颖候选化合物 22。该化合物在实验性变态反应性脑脊髓炎模型（EAE）小鼠上表现出明显的疗效，具有重要的应用价值。

Reference：

[1] Wegner, K. W.; et al. Complex pathologic roles of RIPK1 and RIPK3: movingbeyond necroptosis. Trends Pharmacol.Sci. 2017, 38, 202−225.

[2] Shao, L.; et al. The contribution of necroptosis in neurodegenerative diseases.Neurochem. Res. 2017, 42, 2117−2126.

[3] Yoshikawa, M.; et al. Discovery of 7‐Oxo-2,4,5,7-tetrahydro‐6Hpyrazolo[3,4‐c]pyridineDerivatives as Potent, Orally Available, and Brain Penetrating ReceptorInteracting Protein 1 (RIP1) Kinase Inhibitors: Analysis of Structure−KineticRelationships. J. Med. Chem. 2018, 61,2384−2409.

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