原名：Polysaccharides from fermented Momordicacharantia L. with Lactobacillus plantarum NCU116 amelioratemetabolic disorders and gut microbiota change in obese rats

译名：苦瓜发酵多糖与植物乳杆菌NCU116联合应用改善肥胖大鼠代谢紊乱及肠道菌群变化

期刊：Food & Function

IF：4.171

发表时间：2021.2.11

通讯作者：谢明勇、聂少平

通讯作者单位：南昌大学中国-加拿大食品科学与技术联合实验室

1、FP和NFP治疗对体重和血脂水平的影响

体重和血脂水平（TC，总胆固醇；TG，三酰甘油；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇）如图1和表1所示。与未治疗组相比，FP和NFP治疗组显著降低肥胖大鼠的体重（p<0.05）。摄入FP可显著降低肥胖大鼠TC和TG水平（低剂量FP组除外）（p<0.01），而LDL-C水平无明显改善。此外，FP和NFP能显著提高肥胖大鼠HDL-C水平（p<0.01）。

图1 不同组的体重。正常（N），正常饲料；模型（M），高脂饲料。N+FPM，正常饲料加发酵苦瓜汁多糖，中剂量100mg/kg；N+NFP，正常饲料加非发酵苦瓜汁多糖，中剂量100mg/kg；FPL，高脂饲料加发酵苦瓜汁多糖，低剂量50mg/kg；FPM，高脂饲料加发酵苦瓜汁，中剂量100mg/kg；FPH，高脂饲料加发酵苦瓜汁多糖，高剂量200mg/kg；NFP，高脂饲料加发酵苦瓜汁多糖，中剂量100mg/kg。

表1 不同组的血脂水平

2、代谢物及其变化分析

从METLIN MS和MS/MS数据库中鉴定出103种代谢物。PLS-DA得分散点图显示正常和肥胖大鼠之间存在明显差异。代谢物正离子模式（A，R² = 0.94977，Q²= 0.85756）和负离子模式（B，R²= 0.95079，Q² =0.4806）下模型的R²（描述拟合优度）和预测的Q²（交叉验证后估计预测能力）分别如图2A和2B所示，表明PLS-DA模型是可靠的。在筛选出片段离子、同位素注释和加合离子后，共鉴定出103种代谢物，其中18种代谢物在模型组和正常组之间存在差异（表2）。代谢物包括胺、羧酸、脂肪酰、甘油磷脂、吲哚和衍生物。八种明显改变的代谢物符合VIP>1的标准（图2A，VIP>1的代谢物被认为是潜在的生物标记物）。其中，模型（M）组L-谷氨酸、二十二碳五烯酸（22n-3）、异戊二酸、异戊烯酸、赖氨酸（20:4）均低于正常（N）组，而12S-HHTrE、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸乙酯均高于M组（p<0.01）。从正离子和负离子模式进行多组分析，评估整体代谢组学改变。根据数据结果，PCA模型显示N、M、FPL、FPM、FPH和NFP组之间存在明显的分离（图2C和2D）。提示肥胖病理状态及多糖干预对大鼠血清代谢有明显影响。

图2 模型组和正常组在正离子模式（A，R2= 0.94977，Q2=0.85756）和负离子模式（B，R2=0.95079，Q2 =0.4806）下的PLS-DA评分图。正离子（C）和负离子（D）模式下M、N、FPL、FPM、FPH和NFP组的PCA评分图。

表2 18种不同代谢物与大鼠发生肥胖风险的关系

FP和NFP显著调节肥胖大鼠体内42种代谢物和相关途径。韦恩图（图3C和3D）显示，不同剂量治疗组的代谢物含量增加。低剂量、中剂量和高剂量FP干预分别改善了这42种显著改变的代谢物中的61%、54%和64%。NFP组和FPM组的代谢物改变数量相同。在通过FP和NFP处理改变的10种代谢物（图3B）中，碳烯酸和异辛酸乙酯是潜在的生物标记物。碳烯酸在FPM和FPH中升高（p<0.01）。异辛酸乙酯在FP和NFP各剂量水平的显著增加趋势与M组相似。摄入FP显著影响血清中2-棕榈酰甘油磷酸胆碱、lysoPC（20:2）、lysoPC（20:3）、吲哚乙酸、N-油酰乙醇胺和蝶呤的水平。补充低剂量FP可抑制肥胖大鼠L-蛋氨酸的减少和18-羟基花生四烯酸的增加。与M组相比，FPM组和FPH组的碳烯酸、2-棕榈酰甘油磷酸胆碱、lysoPC（20:2）、lysoPC（20:3）、吲哚乙酸、N-油酰乙醇胺和鞘氨醇水平较高。综上所述，FP和NFP之间代谢产物的差异可能是由于多糖发酵的影响。此外，代谢途径分析（图3E）显示内源性代谢产物参与42条代谢途径。甘油磷脂代谢的影响因子最高，为0.18333；其他途径的影响因子较低，包括鞘氨脂代谢、氨酰tRNA生物合成和柠檬酸循环（TCA循环）、氨基酸代谢（半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢）和嘧啶代谢。这些结果证实血清代谢物对FP治疗有反应，并且FP有效地改善了高脂饮食诱导的血清代谢异常（表3）。

图3 （A）基于8种显著交替代谢物的重要代谢物热图符合VIP>1的标准。（B） 18种代谢物（模型和正常大鼠之间的干扰代谢物）中的10种的热图通过FP和NFP治疗显著改变。用韦恩图（C）和柱状图（D）评价FP和NFP对肥胖大鼠的治疗效果。（E）经FP和NFP改良的42种代谢物的途径分析。

表3 与N组相比，FP和NFP改善了M组中改变的10种代谢物

3、补充FP组和NFP组改变肠道微生物群

从纲、目、门、科、属、种的水平分析了不同试验组肠道微生物群落结构。相对丰度条形图（图4A）和获得了群落在门水平上的分布分类组成的饼图。在门水平上，结肠内容物微生物组的总体组成由Firmicutes和Bacteroidetes控制。其他门包括Proteobacteria，Spirochaetes和一些细菌的相对丰度较低，其中Firmicutes 和 Bacteroidetes的相对丰度分别为60.59%和29.51%。与N组相比，M组Firmicutes的含量增加了2.08%，Bacteroidetes的含量减少了3.03%。结果表明，M组Firmicutes/Bacteroidetes比例高于N组和FP处理组。尤其在FPL组，Firmicutes的比例最低，Bacteroidetes的比例最高。蛋白发酵细菌的丰度在各组均增加。此外，与FP组相比，NFP对肠道成分没有影响。因此，植物乳杆菌NCU116发酵可促进多糖调节肠道环境。

然后进行α-多样性分析，这可以提供微生物群落结构的整体情况。基于Chao1指数（图4B）、观察到的属（图4C）和Shannon指数（图4D），正常和肥胖大鼠之间的α-多样性没有显著差异。FP治疗后，除FPH和NFP组外，与M组相比，Chao1指数显著增加（图4B）。同时，多糖处理组和正常对照组的Shannon指数均高于M组，除NFP组外，其余观察属均表现出相同的趋势。上述结果表明，补充FP可增加肠道微生物群的多样性。

进行相关性分析以可视化不同特征之间的总体相关性（图4E）。各类群的属间相关性分析表明，相关网络中有19种细菌（p<0.05，相关指数>0.5），包括Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria,Actinobacteria和Spirochaetes。对于Firmicutes，Dorea和Roseburia与未鉴定的细菌属（属于Lachnospiraceae）呈较强的正相关（相关指数>0.8）。Allobaculum与Bifidobacterium（放线杆菌属）呈显著正相关（相关系数为0.81），与Clostridium、Prevotella呈显著负相关。Bacteroides与Bifidobacterium, Desulfovibrio和 rc4_4呈负相关。

图4 （A）应用条形图对门级群落的分类组成进行了研究。在OTU水平上使用Chao1（B）、observed（C）和Shannon指数（D）进行α-多样性测量，用箱线图表示。每个箱线图表示组类别中存在的组的多样性分布（B，p值：0.0045269；方差分析F值：4.3049；C，p值：0.00082031；方差分析F值：5.7032；D，p值：0.78422；方差分析F值：0.4856）。（E） SparCC相关网络（各组相关值均>0.5，p<0.05）。不同的颜色表示不同的群，圆圈大小表示细菌的含量。红线和蓝线分别表示正相关和负相关。

为了确定FP和NFP治疗后与肥胖症改善相关的特定细菌类群，使用Lefse分析在属水平上比较了六组的肠道微生物群（图5）。图5A中的数据显示正常组的优势菌为乳酸菌、螺旋菌和厌氧菌，而模型组的优势菌为Turicibacter、Allobaculum、Sutterella、Blautia和双歧杆菌，这表明HFD喂养大鼠的肠道共生被破坏（图5A）。在FP组，肠道微生物群的显著特征是Allobaculum (FPL), Turicibacter(FPL), Helicobacter (FPL), Bifidobacterium (FPM)和Blautia (FPH)显著增加。此外，在NFP组中，Sutterella和Coprococcus的丰度最高（图5B和5C）。FP和NFP都重塑了肠道微生物群的组成。

图5 属水平的Lefse分析（LDA评分>3，p<0.05，FDR<0.1）。（A）M组和N组之间的LDA结果。（B）所有组的LDA结果。（C）根据LDA结果，所有组的细菌在属水平上都发生了显著变化。

4、宿主表型、血清代谢物和肠道微生物群之间的相关性

使用Spearman相关系数（图6）分析体重、血脂、多糖改善血清代谢物和肠道微生物群（基于Lefse分析结果）之间的相关性。结果发现，主要多糖改善血清代谢物与肠道菌群显著相关。对于脂肪酰基，异辛酸乙酯与Bifidobacterium (phylum Actinobacteria),Sutterella (phylum Proteobacteria), Allobaculum和 Turicibacter (phylum Firmicutes)和Lactobacillus (phylum Firmicutes)呈负相关（p<0.05）（r>0.3）。此外，异辛酸乙酯与HDL-C呈正相关（r>0.5）。碳烯酸与体重、TC、TG和LDL-C呈负相关，与HDL-C呈正相关，甘油磷脂与双歧杆菌（放线菌门）呈弱相关（r<0.1）（p<0.05）。相关结果表明，FP-和NFP-处理之后中的代谢物、肠道微生物群和宿主表型构成相互影响的三角关系。此外，FP引起的血脂变化可能改变宿主的代谢。

图6 Spearman’s相关系数中宿主表型、血清代谢物和肠道微生物群之间的相关性。

肥胖是一种严重的慢性疾病，通常伴随着代谢紊乱和肠道菌群失衡而发生。已有研究表明，乳酸菌发酵的多糖具有抗氧化、抗糖尿病、降血脂等作用，并能改善肠道屏障功能。因此，本研究旨在探讨植物乳杆菌NCU116发酵多糖对肥胖大鼠代谢紊乱及肠道菌群的影响。在这项研究中，基于LC-MS/MS的代谢组学方法被用于分析肥胖患者的血清谱。在肥胖大鼠中，发现FP和NFP通过改变羧酸及其衍生物、脂肪酰、甘油磷酸胆碱、吲哚及其衍生物，调节相关途径改善肥胖大鼠的代谢紊乱。然后，还测定了肠道细菌群落组成，细菌门丰度的Firmicutes/Bacteroidetes比率与肥胖有关，在治疗组中下调。因此，FP和NFP对肠道环境有影响，相关结果揭示了改变的细菌和改善的代谢物之间的联系。

研究结果表明，FP和NFP调节肥胖破坏的代谢途径，其中对磷脂酰胆碱的影响参与甘油磷脂代谢，相关的途径影响因子最高（图3E）。磷脂酰胆碱能减轻HFD引起的肥胖和肥胖相关的并发症，如高脂血症、心血管疾病和NAFLD。此外，甘油磷脂与TC和TG呈负相关（图6）。FP组LysoPC（20:2）和LysoPC（20:3）均升高，与磷脂酰胆碱能促进胆固醇分泌，预防胆固醇中毒，脂肪酸合成和促进胆固醇氧化成胆盐以降低胆固醇水平的报道一致。因此，本文推测FP和NFP治疗可以通过调节甘油磷脂代谢来恢复血脂异常。同时，磷脂酰胆碱与有益细菌如Bifidobacterium, Allobaculum和 Anaerostipes属呈正相关，因此FP组磷脂酰胆碱的增加抑制了肥胖症的发展，这也与肠道菌群的调节有关。在本文的结果中，二十烷酸、脂肪酸酯和长链脂肪酸被归类为脂肪酰基。参与花生四烯酸代谢的花生四烯酸（16（R）-HETE、8-HETE和18-羟基花生四烯酸）在治疗大鼠体内含量较高。花生四烯酸也受到磷脂酰胆碱的调节，磷脂酰胆碱参与甘油磷脂代谢。此外，18-羟基花生四烯酸与Bifidobacterium和Allobaculum呈显著正相关。花生四烯酸对肥胖的干预作用可能是通过肠乳糜，改变脂肪细胞褐变方式，促进脂肪代谢。花生酸乙酯、十六酸乙酯、二十酸乙酯和十四酰肉碱的脂肪酸酯也通过参与脂肪酸代谢来调节。众所周知，异辛酸乙酯可以改善非胰岛素依赖型糖尿病患者的胰岛素抵抗。给予FP和NFP可显著增加肥胖大鼠的异辛酸乙酯，异辛酸乙酯治疗可有效稳定急性冠脉综合征患者的斑块。

中剂量FP能显著改善肥胖大鼠鞘氨醇脂质代谢对鞘氨醇含量的影响。N-油酰乙醇胺对大鼠有抗炎和厌食作用。FP和NFP中高含量的N-油酰乙醇胺可能抑制食欲，导致脂质沉积减少。N-油酰乙醇胺与Bifidobacterium, Allobaculum和 Anaerostipes显著正相关。因此，双歧杆菌的增加可能通过促进鞘氨脂的分泌来控制食欲，而厌食症的发生可能与肠道菌群的改变有关。对于其他代谢物，异柠檬酸仅在涉及柠檬酸循环（TCA循环）的FPL组中显示出增加趋势。肥胖脂肪组织的动力学增加可能与葡萄糖作为TCA循环的底物的掺入有关。此外，糖尿病大鼠体内TCA循环中间产物的排泄量增加，表明糖酵解受到抑制，糖尿病发展过程中有氧代谢得到促进。因此，肥胖的改善在某种程度上与TCA循环的改变有关。在补充多糖后，嘧啶代谢的代谢物（胞苷、核糖胸苷）也得到改善。所有治疗组的核糖胸苷均显著下调，而胞苷仅被NFP改变。

通过Lefse分析，本文在肠道中发现了不同的微生物群落。在厚壁菌中，肥胖大鼠的乳酸菌属和厌氧菌属成员减少，而FP和NFP治疗组的乳酸菌属和厌氧菌属成员增加，并且与体重和血脂呈负相关（图6）。这些结果表明，多糖增加物种丰富度，调节肠道微生物群落结构，减轻大鼠肥胖。

综上所述，肥胖引发了宿主代谢和肠道微生物群的紊乱。添加植物乳杆菌NCU116（FP和NFP）的发酵和非发酵苦瓜多糖可显著减轻肥胖，降低体重、血清TC、TG和LDL-C水平。FP和NFP可改善肠道菌群和血清代谢的失衡。在本研究中，FP和NFP组通过调节42种代谢物来缓解宿主代谢紊乱，并且FP还显著调节肥胖风险的潜在生物标志物。FP改变了甘油磷脂代谢、氨基酸代谢、TCA循环、鞘脂代谢、嘧啶代谢等重要的生物学途径和过程。此外，FP和NFP提高了物种丰富度，调节了肠道微生物群的结构和组成，改善了肥胖症引起的微生物失调。植物NCU116发酵苦瓜多糖对大鼠有益菌的生长有促进作用。FP治疗组的厚Firmicutes/Bacteroidetes比率较低，尤其是FPL组。同时，FP增加了Lactobacillus, Bifidobacterium,Allobaculum和Anaerostipes，减少了Blautia和Helicobacter。FP组有益双歧杆菌的升高与参与调节血脂的代谢物有关。这种相关性可能揭示了血清代谢组和肠道菌群在FP的减肥作用中起着重要作用。因此，FP可作为一种潜在的膳食补充剂，通过调节肠道菌群和宿主代谢发挥减肥作用。植物发酵可促进多糖对肥胖大鼠的减肥作用和提高多糖的生物活性，为今后开发具有防治肥胖症作用的益生菌产品提供参考。

本文为了最大限度地发挥益生菌发酵多糖对肥胖的潜在有效干预作用，结合肠道菌群分析和代谢产物分析，研究了植物乳杆菌NCU116发酵苦瓜多糖对肥胖大鼠的影响。代谢组学和肠道菌群分析的结果可能为开发益生菌产品提供理论依据，并为益生菌发酵多糖治疗肥胖症的分子机制提供新的认识。研究结果发现，添加植物乳杆菌NCU116（FP和NFP）的发酵和非发酵苦瓜多糖可显著减轻肥胖，降低体重、血清TC、TG和LDL-C水平，并且能够改善肥胖大鼠代谢和肠道菌群紊乱。这项研究的结果可以为将来开发益生菌产品提供信息，这些产品可能对预防或治疗肥胖症有有益的作用。