高通量测序又称下一代测序（Next generation sequencing，NGS），其较传统的Sanger测序（第一代测序）具有划时代的意义。自454焦磷酸测序技术推出以来，引发了测序技术创新发展的激烈竞争。近年来，各种测序技术及仪器不断推出，包括第三代测序技术的诞生和发展，测序通量不断提升，测序成本也不断降低，但是第一代测序通量低，步骤繁琐，花费高的缺点使得一代测序技术难以大规模的推行应用；第二代测序技术通量高，自动化水平高，测序成本低（1000美元可以完成一个人的基因组测序），是目前测序的主流；三代测序技术以纳米孔测序技术为代表，其主要技术特点是超长读长、读取速度快、高通量和便携性，但是错误率非常的高。尽管高通量测序仪器不断推陈出新，但只要理解了高通量测序的基本原理与方法，较好的把握高通量测序的发展脉络，则更有助于理解下游的生物信息学分析过程。本文主要对目前主流的测序平台Illumina测序的原理与特点进行介绍，放在这里也方便自己翻阅。

Illumina的测序原理为边合成边测序主要有以下四个步骤：

1.基因组DNA抽提：根据不同的研究目的选用不同的DNA抽提试剂盒，进行基因组DNA的抽提，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

2.DNA文库的构建：高通量测序只能测定500bp以下的片段，因此需要将提取出来的基因组DNA片段化，目前主要有两种方法：超声波机械打断（得到100～1500bp或2～5kb的片段）；非特异性核酸内切酶打断（得到100～800bp的片段）。不同的测序目的有不同的建库方法，此处举例全基因组的的NGS文库构建，具体的步骤如下图所示：

注意：文库构建完成后指控非常的重要，主要看两个方面一是片段的大小，二是DNA浓度，DNA浓度直接影响着后面测序时候的reads数，从而导致测序不准确。

Step2中构建文库过程与分子结构：

图1 NGS文库构建步骤示例

图2 标准文库的分子结构

3.文库构建完毕后，上样进行Flowcell（流动池）吸附：Flowcell中随机分布着不同的寡核苷酸序列（P5’和P7’），可分别与待测DNA上的接头P5和P7互补结合。为了区分不同样本产生的reads，分别加入不同的index，由此通过测序之前确定的标签与样本DNA的关系可以分别获取不同样本DNA的测序数据；其中Flowcell是一种有2个或8个泳道的玻璃板，每个泳道根据不同需求可以检测一个或多个样本。

图3 8泳道Flowcell

 图4通过共价键连接在Flowcell中的引物

4.桥式PCR扩增：目的在于将碱基信号强度放大，以达到测序需要的信号要求。待测DNA序列通过接头序列（P5和P7）与Flowcell上的序列（P5’和P7’）杂交互补，以待测DNA序列为模版进行互补链延伸，然后模版链被切断并被洗下去除；随后互补链与Flowcell上的接头序列杂交互补，进行链的合成，这个过程就是桥式PCR。接下来合成的双链再经过解链，与Flowcell上接头杂交，延伸并不断重复多个循环，最终每个DNA片段都在各自的位置上集中成束，每一束含有多个DNA模板片段的拷贝。Flowcell中每个泳道有两列，每列有60个小区（tile），在每个tile中可生成不同的DNA簇（cluster）。

图5 桥式PCR扩增示意图

5.测序 通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。采用可逆阻断技术，反应体系包含DNA聚合酶、接头引物和带有荧光标记的4种dNTP。随后洗脱反应，加入激发荧光所需的试剂并用激光进行激发、采集荧光信号分析后识别碱基，再加入化学试剂淬灭荧光信号并除去dNTP3’端的保护，进行下一轮的反应。每个tile在每个循环中拍照四次，每个碱基1次。

图6 Illumina测序整体流程

图7 双端测序过程

注：以上内容主要引用李金明主编的《高通量测序技术》，部分图片来源于B站UP主bioDATA_Mining的视频“零基础生信入门--高通量测序的基本原理”。若有侵权，请联系删除。

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