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《自然》重大突破!张毅团队破解eccDNA“人生三问”:从哪来?怎么来?做什么?

已有 1284 次阅读 2021-10-21 09:00 |个人分类:小柯生命|系统分类:论文交流

作为生命的遗传物质,DNA可分为线性和环状两种。真核生物基因组染色体DNA以线性方式存在,而细胞器(线粒体和叶绿体)、绝大多数细菌、部分病毒基因组DNA则以环状形式存在。染色体之外环状DNA(eccDNA,extrachromosomal circular DNA)指在真核生物中发现的,染色体外的、非线粒体、非叶绿体环状结构DNA。eccDNA的发现(1964)【1】甚至早于广泛熟知的线粒体DNA【2-4】和细菌质粒DNA【5-6】,两者分别于1966年和 1967年被显微镜观察证实为环状。


历经多半个世纪的研究,人们对eccDNA与基因组DNA的序列高度同源,已经达成共识,但因其尺寸差异巨大:从数百bp(碱基对)到数百kb(千碱基对)不等,研究人员据此提出了多种命名,microDNA主要指400 bp以内的环状DNA【7】,ecDNA (extrachromosomal DNA)【8】被用以描述在癌细胞中发现的、尺寸数百kb以上的染色体外DNA,其巨大尺寸,足以容纳全长基因和DNA复制起始位点,因此能自主复制和扩增,并与癌基因的扩增和癌症的发生有关。 而eccDNA正被用来指比ecDNA小的所有染色体外环状DNA,这些eccDNA几乎存在于所有的真核细胞系和组织器官中,与染色体DNA相比较,其丰度极低,含量易变。

迄今为止,关于eccDNA三大基本问题仍然没有答案:1,eccDNA与基因组的序列同源性是否具备特异性(从哪来)?2,eccDNA的产生机制是什么(怎么来)?3,eccDNA有无生物学功能(做什么)?


近期美国哈佛医学院、波士顿儿童医院张毅教授实验室以长文的形式在《自然》杂志,发表了题为“eccDNAs are apoptotic products with high innate immunostimulatory activity”的研究,对上述三个基本问题做出了回答。


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张毅教授实验室在表观遗传在胚胎早期发育的调控作用,做了大量杰出的工作【9-15】。早期胚胎发育过程中,基因组中大量的转座子、逆转座子会被激活。这些激活的转座子及逆转座子可能会再插入,破坏基因组稳定性。因此胚胎如何避免活性转座子、逆转座子对基因组的破坏,是一个重要的科学问题。其中一个合理的假说是:激活后转座子和逆转座子最终以eccDNA方式存在,而避免了重新插入破坏基因组。为了验证这一假说,张毅教授实验室五年前开始对eccDNA展开研究。


有效地分离和纯化研究对象,是取得研究进展的先决条件。eccDNA在生物样本中丰度极低而其环状结构又极易受损,双链上任意位点的断裂均会将环状变成线性,而导致其丢失。有效的分离纯化一直是eccDNA 研究的一大难题。传统的eccDNA分离纯化方法主要分为两步:1、碱性裂解复性粗提环状DNA;2、核酸外切酶选择性消化线性DNA。然而,文章作者发现,传统的eccDNA纯化方法远不能有效分离到满意纯度的环状DNA, eccDNA样品中60-80%的分子仍然呈线性,这与近10年来的研究报道中的结果一致。作者推测,天然生物样本中的DNA,可能存在多种修饰和复杂结构,如氧化(oxidation)、交联(cross-link),DNA复制叉、十字结(Cruciform)、脱氧鸟嘌呤四联体(G-quadruplex)等。这些复杂结构,极可能抑制了核酸外切酶的作用,使单依靠核酸外切酶消化、得到纯环状DNA,变得不可能。鉴于此,研究人员在优化传统的碱性粗提环状DNA和核酸外切酶消化线性DNA的基础上,增加了一个纯化步骤:从核酸外切酶消化产物中选择性回收环状DNA。新的方法实现了eccDNA样品在显微镜镜检时,95%以上的DNA分子呈环状图1)。与此同时,新方法还有耗时短、稳定性高的特点:将传统耗时一周的分离纯化过程压缩到一天内完成;对平行样品、批次样品间的eccDNA纯化,表现出很好的平行性和高可再现性。


为了得到每一个eccDNA分子环的准确序列信息,研究人员还将滚环扩增(rolling cycle amplification)和第三代的纳米孔测序技术(Oxford Nanopore)结合(图1),实现了仅用三代测序获取eccDNA的全长序列。


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图1,(a) 新的环状DNA的纯化和测序方法;(b) eccDNA琼脂糖凝胶电泳图;(c)eccDNA分子的原子力显微镜镜检图。

 

为了避免普通细胞系基因组中可能存在的突变、重组、结构紊乱等因素对其eccDNA与参考基因组DNA(reference genome)序列同源比对分析的影响,作者选择从基因组相对稳定的小鼠胚胎干细胞系中提取eccDNA进行研究,获取了160多万个eccDNA分子的全长序列信息及基因组来源位置信息。分析发现,eccDNA随机来源于基因组片段,包括单片段自环化和多片段连接环化,大小集中在200bp到3kb之间,分布近似于寡聚核小体(oligo-nucleosome)间的尺寸分布规律。这些结果预示eccDNA可能是基因组DNA随机断裂产生片段的环化产物。


细胞凋亡是广泛发生于真核生物体内、和体外培养细胞中的程序性细胞死亡,其中一个重要特征就是细胞凋亡过程中,特定的核酸酶会在核小体的间区切断基因组DNA,形成寡聚核小体大小规律分布的线性片段化DNA(ladder-like)。因此作者比较了正常培养细胞和诱导凋亡的细胞中的eccDNA含量,发现凋亡细胞中的eccDNA量明显增加,说明凋亡能诱导eccDNA的发生。


为了弄清eccDNA的产生是否源于片段化的DNA,作者鉴定并敲除了小鼠干细胞中负责凋亡DNA片段化的核酸酶DNase1l3,得到了凋亡DNA片段化缺陷的细胞株(DNase1l3 KO),DNase1l3的敲除并不影响细胞凋亡导致的细胞死亡,但其凋亡寡聚核小体样的DNA片段化的现象则完全丧失,相应的是,DNase1l3 KO细胞系也失去了凋亡诱导的eccDNA发生的能力(图2);这说明eccDNA发生源于凋亡产生的DNA片段。


线性DNA片段的环化离不开DNA连接酶(DNA ligase),真核生物共有三个DNA连接酶基因:Lig1,Lig3和Lig4。通过建立DNA连接酶的单基因敲除和多基因敲除细胞系。研究人员发现,Lig1和Lig4的缺失完全不妨碍eccDNA的生成,而Lig3缺失的细胞系中的eccDNA产量则急剧降低,说明Lig3是最主要的负责DNA环化的连接酶(图2)。这回答了eccDNA是怎么发生的问题。

 

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图2,(a-b)凋亡DNA片段化缺失细胞(DNase1l3 KO)不能产生eccDNA;(c)Lig3的缺失抑制了eccDNA的产生。

 

随后,研究人员挑战了eccDNA的第三大基本问题:eccDNA是否有功能?鉴于eccDNA在序列上没有表现出明显的特征,作者首先排除基于序列来探索eccDNA的整体生物学功能的可能。文章作者通过检阅文献发现,先天免疫(innate immunity)过程中的重要蛋白,如HMGB1,TLR9等对DNA的弯折(curvature,bending)结构表现出了更高的亲和力,因此推测,所有eccDNA分子的共性——环状结构或许在先天免疫反应中有特殊作用。


随后的研究证实了这一推测:eccDNA的环状特性赋予其超强的刺激先天免疫反应的能力。在典型的免疫细胞——树突细胞(BMDC,bone marrow derived dendritic cells)和巨噬细胞(BMDM,bone marrow derived macrophages)中,相比于同大小的线性基因组DNA片段, eccDNA能诱导出更高的细胞因子(图3)(Ⅰ型干扰素(IFN-α,β), 白介素6(TNF-α), 肿瘤坏死因子(TNF-α)等)的表达,显示出超强的刺激免疫反应的能力。当eccDNA分子环被单位点切断成对应的线性分子后,即失去了刺激免疫反应的超强能力(图3),证实了eccDNA的强效免疫刺激能力依赖于其环状结构。为了进一步排除eccDNA序列及潜在的转录对免疫刺激影响,作者用与eccDNA相似大小、但序列为随机生成的、人工合成环状DNA处理免疫细胞,不出预料,人工合成的DNA环完美再现了纯化的天然eccDNA对免疫细胞的超强刺激能力(图3)。深入研究显示,eccDNA的超强先天免疫刺激能力依赖于胞内Sting信号途径而非Myd88信号途径。


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图3,(a)eccDNA具有超强的诱导干扰素IFN-β表达的能力(d)eccDNA被线性化(Li-DNA)后失去诱导干扰素IFN-β表达的能力;(c)人工合成的随机序列DNA环具有超强的诱导干扰素IFN-β表达的能力;(d)eccDNA对免疫的刺激依赖于Sting信号途径而非Myd88信号途径。


总之,该研究就长达半个多世纪的eccDNA谜题,在三个最基本的方向上给出了清晰的答案:1,eccDNA随机来源于染色体基因组DNA,没有明显的位置或序列的特异性(从哪来),2,eccDNA是Lig3介导的凋亡DNA片段的环化产物(怎么来),3,eccDNA具有超强的刺激先天免疫反应的能力(能做什么)。该研究对细胞凋亡和先天免疫两大领域具有深远的影响,特别是对短时间内产生大量细胞死亡的多种疾病、或疾病治疗过程,如细菌、病毒的急性致命传染病、癌症的免疫治疗等。此外,该研究也对核酸疫苗和疫苗佐剂(adjuvant)的设计提供了新的设计思路和路径。

 

张毅教授为本文的通讯作者,王元高博士为本文的第一作者。王萌博士、Mohamed Nadhir Djekidel博士、陈欢博士、刘迪博士和Frederick Alt教授亦对本研究做出重要贡献。该研究中,原子力显微镜的使用得到了Wyss研究所的Yin Peng教授的倾情相助.

 

相关论文信息:

https://doi.org/10.1038/s41586-021-04009-w


参考文献

1,Hotta, Y. & Bassel, A. Molecular Size and Circularity of DNA in Cells of Mammals and Higher Plants. Proc Natl Acad Sci U S A 53, 356-362, doi:10.1073/pnas.53.2.356 (1965).

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4,Nass, M.M., 1966. The circularity of mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 56(4), p.1215.

5,Roth, T.F. and Helinski, D.R., 1967. Evidence for circular DNA forms of a bacterial plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 58(2), p.650.

6,Hickson, F.T., Roth, T.F. and Helinski, D.R., 1967. Circular DNA forms of a bacterial sex factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 58(4), p.1731.

7,Shibata, Y., Kumar, P., Layer, R., Willcox, S., Gagan, J.R., Griffith, J.D. and Dutta, A., 2012. Extrachromosomal microDNAs and chromosomal microdeletions in normal tissues. Science, 336(6077), pp.82-86.

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9,Inoue, A. and Zhang, Y., 2014. Nucleosome assembly is required for nuclear pore complex assembly in mouse zygotes. Nature structural & molecular biology, 21(7), pp.609-616.

10,Lu, F. and Zhang, Y., 2015. Cell totipotency: molecular features, induction, and maintenance. National science review, 2(2), pp.217-225.

11,Lu, F., Liu, Y., Inoue, A., Suzuki, T., Zhao, K. and Zhang, Y., 2016. Establishing chromatin regulatory landscape during mouse preimplantation development. Cell, 165(6), pp.1375-1388.

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14,Chen, Z. and Zhang, Y., 2020. Maternal H3K27me3-dependent autosomal and X chromosome imprinting. Nature Reviews Genetics, pp.1-17.

15,Chen, Z., Djekidel, M.N. and Zhang, Y., 2021. Distinct dynamics and functions of H2AK119ub1 and H3K27me3 in mouse preimplantation embryos. Nature Genetics, 53(4), pp.551-563.




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1 关勇军

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