题目：Calcium-Dependent Protein Kinase CPK1 Controls Cell Death by In Vivo Phosphorylation of Senescence Master Regulator ORE1

发表期刊：Plant Cell  IF:8

作者：柏林自由大学生物研究所达勒姆植物科学中心Guido Durian研究团队

文章主要内容:

作者在发育的叶片衰老过程中发现了一个新的关键的调控层：钙依赖蛋白激酶CPK1通过直接磷酸化转录因子ORE1，调节衰老和叶片细胞死亡。

• CPK1在一个本质上无序的区域内磷酸化ORE1，这增强了ORE1的下游靶基因双功能核酸酶1 (BFN1)的转录激活。

• 过表达ORE1，会促进植物早期衰老。

• 在CPK1信号诱导的细胞死亡中，ORE1是必需的。

【亮点】将CPK1与衰老相关细胞死亡的诱导联系起来；作者在筛选CPK1体内磷酸化底物时设计的试验方法很巧妙；

【困惑】作者在检测早衰表型是都是用细胞死亡来观察的，那要如何区分是这个细胞死亡是早衰引起的还是免疫激活引起的，毕竟CDPK在免疫中的报道也很多？

CPK1和钙离子的中间是否还存在其他的蛋白来行使功能？

ORE1的靶标有很多，仅仅只有BFN1在其被CPK1磷酸化后起作用吗?

背景涉及知识：

• 拟南芥保卫细胞表达的CPKs已被证明可以磷酸化并激活保卫细胞阴离子通道SLAH3和SLAC1从而控制气孔离子电导和关闭。

• 质膜定位的NADPH-氧化酶呼吸爆发氧化酶同系物D是CPKs在体内的直接底物

• CPKs还可以磷酸化ABF和WRKY转录因子，分别介导ABA和防御信号途径

• CPK1属于CDPK基因家族的亚组1，该家族包含几个在植物逆境信号传递中具有功能的成员

• 转录因子ORE1 (ORESARA1/ANAC092)是发育性叶片衰老的主要调控因子，它控制着一个与衰老相关的基因调控网络，该网络是后续养分再活化和叶绿素降解所必需的，ORE1的表达本身受到叶龄和非生物胁迫的严格控制，这些胁迫包括氮素限制、黑暗和盐被认为可以促进衰老；

• 幼叶中，高水平的miR164转录后抑制ORE1的表达，而在老叶中miR164水平下降，从而缓解抑制；此外，老叶中，ORE1的表达不仅被乙烯信号的关键调节因子上游转录因子EIN3和ABA诱导的转录因子ATAF1直接激活，而且还可以被生物钟成分PRR9激活；在生物过程中ORE1通常被泛素化和反泛素化调节；

【试验方法补充】

磷酸化蛋白质组鉴定

磷酸化蛋白质组全谱鉴定以组织、细胞等较为复杂样本为研究对象，目的在于鉴定样品中发生磷酸化的蛋白质以及相应的磷酸化位点。首先对蛋白样本进行酶解，TiO2 或 IMAC-Fe 或 IMAC-Ti 富集磷酸化多肽，5600-plus 质谱检测，利用得到的质谱谱图与相应数据库搜索比较，从而得到肽段序列结果，同时通过生物信息软件计算出磷酸化位点。来源：丁香园

利用台酚蓝染色＋叶绿素荧光测量测细胞死亡

结果部分.pdf