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论文赏析:早期肝癌的血液检测:甲基化与蛋白标志物联检法(HepaClear)

已有 1043 次阅读 2023-9-16 00:00 |系统分类:论文交流

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论文赏析:

早期肝癌的血液检测:甲基化与蛋白标志物联检法(HepaClear)

本研究的目的是通过血液样本的甲基化qMSP和蛋白标志物联检早期发现肝细胞癌。研究包括四大部分内容:

内容

样本

方法要点

结果

靶点发现

60对组织样本(肝细胞癌和非癌对照)

用850k甲基化芯片测试——甲基化水平(β值)——甲基化数据分析(使用 R 包IMA进行)—— |Δβ|> 0.1且p值 < 0.05——差异显著性CpG位点——候选靶标

找到10个CpG位点(DMP)

qPCR检测体系建立

60对组织样本(肝细胞癌和非癌对照)——150个血液样本

针对10个候选CpG位点靶标,用组织样本建立qPCR检测方法——用150个血液样本对qPCR检测方法进行验证

筛选出6个CpG 甲基化位点

建模与靶点组合筛选

150个血液样本

qPCR甲基化数据+蛋白检测数据和金标准检测数据——逻辑回归模型——ROC分析——阳性判断值分析——最佳模型(3个CpG 甲基化位点+2个蛋白标志物)

建立检测模型

最佳模型的评价

296个血液样本(训练集)和198个样本(验证集)

用296个血液样本收集数据(qPCR甲基化数据+蛋白检测数据和金标准检测数据)——ROC分析——用198个血液样本收集数据(qPCR甲基化数据+蛋白检测数据和金标准检测数据)————ROC分析——肝癌早筛试剂HepaClear

HepaClear训练集与验证集结果一致,灵敏度高,可用于肝癌早筛

研究流程图

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结果

最佳标记物组合HepaClear :包含 3 个高甲基化 CpG 位点(cg14263942、cg12701184 和 cg14570307)和 2 个蛋白质标记物(AFP 和 DCP)。

150个血液样本的标记物评分由以下逻辑回归方程得出:Score = 30.9062 − 0.3385 × cg14263942 − 0.2114 × cg12701184 − 0.2202 × cg14570307 + 0.3362 × log2AFP + 0.2656 × log2DCP. 

cg14263942、cg12701184和cg14570307是3个甲基化位点的甲基化水平变量(ΔCt;AFP和DCP是蛋白标记的表达水平变量

将样本的标记物得分(Score)与临床病理检查的金标准结果相结合进行ROC曲线分析,得到以下结果:

HepaClear-PCR检测体系的测试结果如下:

试验

血浆样本数

灵敏度

特异性

训练集测试结果

296 个

82.6%

96.2%

验证集测试结果

198个

84.7%

92.0%

 

图表欣赏

1A、火山图:本研究采取850k芯片在60对组织样本中探测到不同CpG位点及其甲基化水平数据,按照肝癌与对照的甲基化水平差异情况绘制出火山图。火山图的横坐标是β值,即肝癌与非肝癌组织样本的甲基化水平之差值;纵坐标是βt测验得到的显著性概率p值的对数(该值越大表示肝癌与对照的甲基化水平差异越显著)。图中的n代表CpG位点数,图中的每一个坐标点代表一个CpG位点。绿色部分是肿瘤与非肿瘤的β小于0.1的CpG位点,蓝色部分是肿瘤低甲基化的CpG位点(n=216246),红色是高甲基化位点(n=31837个)(可见低甲基化位点在数量上大大多于高甲基化位点)。理想的CpG位点是分布在右上方的红色CpG位点,表现为肝癌与非肝癌甲基化水平差异大,而且p值对数高。


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1B、尽管差异CpG位点有很多,很多位点具有相关性,它们可以通过主成分分析简化为几个不相关的主成分。头两个主成分对总变异的贡献率分别为88.5%和4.2%,累计贡献率达到92.7%,可以将60对肿瘤样本与对照样本较好地分开。

1C、热图中的颜色甲基化β值相对应。行代表不同的 CpG 位点,列代表不同的组织样本。热图来自 1000 个甲基化 CpG 位点的无监督层次聚类分析 

*火山图、主成分分析图、热图的制作见https://ibook.antpedia.com/x/864460.html

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2A、60 对组织样本(HCC 和正常对照)qMSP测试结果:10 个候选CpG 位点的甲基化水平(ΔCt = Ctreference - Cttarget)。y轴代表甲基化水平(ΔCtΔCt越小代表甲基化水平高。****表示p < 0.0001。


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2B150个血浆样本qMSP测试结果:获得8个CpG标志物的甲基化水平,分别进行单CpG标志物ROC分析得到各曲线下面积 (AUC)。AUC > 0.8 和 < 0.8 的标记物分别以红色和蓝色表示。

2C基于150个血浆样本qMSP结果的建模研究4个不同标志物组合ROC分析

 4个不同组合如下:

3 个甲基化 CpG 位点(cg14263942、cg12701184 和 cg14570307)

6 个甲基化 CpG 位点(cg14263942、cg12701184、cg14570307、cg15457058、cg07689503、cg20172627)、

3 个甲基化 CpG 位点+(AFP 和 DCP)

6甲基化 CpG 位点+ AFP 和 DCP 

括号中的数字是AUC值。


1 ROC分析结果:10个高甲基化CpG位点的qMSP检测性能评估(基于150个血液样本)

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3 HepaClear面板 在训练集和验证集中的性能表现:ROC分析

图3A和B: HepaClear面板在训练组中的表现:所有肝癌分期的患者 (A) 和早期患者(B)比较;HepaClear 面板与单独使用蛋白标志物AFP 和 DCP 的性能比较。可以看出HepaClear面板的预测效果优于蛋白标志物AFP 和 DCP。对晚期的预测效果尤佳。

图3 C和D :不同病程(健康对照、CHB、LC 和 HCC) 患者的HepaClear 面板综合得分分布图。可以看出,HepaClear 面板在健康组中综合得分最低,病期越晚得分越高,肝癌患者评分最高。训练集与验证集结果一致。

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