论文赏析

多参数液体活检与肺癌无创诊断和预后

题目：Non-invasive lung cancer diagnosis and prognosis based on multi-analyte liquid biopsy

期刊Mol Cancer. 2021; 20: 23.doi: 10.1186/s12943-021-01323-9

期刊影响因子11.35

1、背景

研究目的：基于血浆cfDNA高通量测序，开发突变位点和甲基化特异性肿瘤标记物，用于肺癌的诊断和预后。

2、研究方法

2.1研究流程：全基因组标记物筛选——标记物模型构建——模型性能评价

2.2检测方法：血浆cfDNA高通量测序（突变和甲基化）

2.2诊断模型：通过随机森林法，对样本的基因突变负荷、甲基化水平和CEA诊断结果建立诊断模型，用于区分肺癌是恶性还是良性。

2.3预后模型：对样本的基因突变负荷和甲基化水平建立多变量Cox比例风险模型，用于肺癌患者的预后分析。

3、结果

3.1突变诊断模型

3.2甲基化诊断模型

3.3多组学诊断模型

3.4突变和甲基化预后模型

4、要点回顾

4.1 NGS测序技术

第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序，是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列。将目标DNA剪切为小片段; 单个小片段DNA分子结合到固相表面，单分子独立扩增，每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号,从而达到DNA测序的目的。NGS较之一代测序成本大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。

靶向NGS测序指通过PCR或者芯片捕获的方式，富集感兴趣的目的区域的READS，然后进行NGS测序。

PANEL测序指针对某种特定疾病或者表型，将相关的候选基因集中起来，只针对这些基因进行NGS测序。

超深靶向NGS测序：NGS测序深度500-1000X甚至更高，有助于发现罕见变异，挖掘疾病相关基因。

重亚硫酸盐测序：该方法可以从单个碱基水平分析基因组中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重亚硫酸盐对基因组DNA进行处理，将未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶。而发生了甲基化的胞嘧啶未发生脱氨基，因而，可以基于此将经重亚硫酸盐处理的和未处理的测序样本进行比较来发现甲基化的位点。

全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）将Bisulfite处理与高通量测序技术相结合，绘制全基因组高分辨率DNA甲基化图谱，可用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联。

4.2诊断与预后模型

逻辑回归模型：预测在不同的自变量（如某基因的甲基化水平）情况下，发生某病或某种情况的概率有多大。常用于研究多个检测靶标与肿瘤发生的关系。逻辑回归分析可得到逻辑回归方程，向方程输入自变量（如不同标记物的甲基化水平）可以得到患某癌症的概率，并根据概率阈值，得出癌症是阳性还是阴性的判断。

随机森林：构建分类模型（如恶性与良性）的一种方法，研究自变量与应变量的关系（作用有点像线性和Logstic回归模型），而不需要考虑自变量的共线性问题，可以很好地预测多达几千个解释变量的作用；即使部分数据缺失，仍可以维持一定的准确度。随机森林可以用于分类和回归，本文与逻辑回归模型作用相同。

生存分析：根据样本生存资料估计总体生存率及其它有关指标， 估计不同时间的生存率 、生存曲线以及中位生存期等 。对不同处理组生存率进行比较，以了解哪种治疗方案较优。探索和了解影响生存时间长短的因素， 或平衡某些因素影响后， 研究某个或某些因素对生存率的影响 。生存分析包括生存表法、KAPLAN-MEIER法、Cox 回归。

多变量Cox比例风险模型：用以解释多个自变量按风险比例对生存时间的效应，得到一个概率值，本研究用于评估肿瘤标记物对患者生存时间的影响。

4.3肿瘤标记物数据库

TCGA数据库：目前共收录了33种癌症类型。涵盖了基因组，转录组，表观遗传，蛋白组等各个组学数据。官方的工具主要功能是查看和下载数据，只有非常简单的分析功能，而第三方工具则侧重于基于TCGA的数据进行分析。

COSMIC数据库：收录了来自不同研究机构和数据库的体细胞突变数据，并提供了方便的浏览，检索，下载功能。