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农用放线菌研究(29):放线菌能“溶解”真菌菌丝 精选

已有 4651 次阅读 2022-7-19 12:53 |个人分类:科研进展|系统分类:科研笔记

 土壤真菌决定植物命运

 我们在长期的土壤连作障碍修复科研实践中发现,向土壤中施用抗病促生多功能放线菌活菌制剂后,土壤根系病害显著减轻或不发病,同时,土壤中的细菌和放线菌数量增加,真菌数量显著减少。真菌减少,是根系病害减轻或消除的主要原因,但真菌减少的机制至今仍不清楚,悬而未决。

土壤真菌种类繁多,数量仅次于细菌,有许多真菌是植物病原菌。土壤中真菌愈多,植物罹患真菌病害的风险愈大,土壤生物质量愈差。根系终生与土壤接触,从种子萌发根系“出生”,到生命结束,根系一刻也不离开土壤,根系不可避免与土壤真菌发生联系,土壤中真菌数量与种类,直接决定植物根系是否发病,植物能否健康生长。土壤真菌决定着植物的命运。

土壤中真菌少,细菌/真菌比值大,土壤的生物质量好,土壤健康程度高,在这种土壤上种植农作物,发生真菌病害的概率很小。

土壤中真菌的数量与种类,细菌/真菌比值,是评价土壤健康水平的重要指标之一。

地球上所有陆生植物均生长于土壤中,土壤是粮食的唯一来源。土壤真菌的种类和数量是决定农作物健康与产量,决定人类的粮食安全的重要因素之一。

放线菌能溶解真菌菌丝

土壤,是由矿物质颗粒和有机质组成的海绵状多孔体。其中,生活着数量巨大的微生物。每克土壤中,微生物数量多达几十亿、几百亿甚至更多。在土壤微颗粒表面和内部的微小孔隙中,微生物细胞密度很大,球状或杆状细菌细胞之间,真菌和放线菌的菌丝之间,真菌与真菌的菌丝之间,不可避免会发生近距离的“亲密接触”。密密麻麻的菌体接触后,会发生激烈的“短兵相接”战斗,或你死我活,或互相促进,相互帮助,彼此生长得更好。菌体之间的战争,通常采用“化学武器”进行。放线菌产生抗生素就是一种化学武器。此外,微生物还能合成一类能分泌到细胞外,可分解菌体细胞壁大分子的特殊蛋白质,其实质是一类具有特定专性降解功能的酶,也是微生物常用化学武器之一。

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1.放线菌溶解棉花黄萎病病原真菌大丽轮枝菌丝(薛磊,2012a)

在土壤中,放线菌与真菌菌丝近距离发生“亲密接触”时会出现什么现象,我们无法直接看见。但可以通过一个试验,直接观察到放线菌菌丝与病原真菌菌丝接触时发生的现象。方法如下:

 采用无菌操技术,在装有固态培养基的培养皿中,用一个U型小铲在培养基上挖出一个很窄的小槽,槽两边分别接种放线菌和病原真菌,槽上搭盖无菌载玻片,28℃培养,琼脂槽两侧的放线菌菌丝与真菌菌丝不断向对方一侧生长,在载玻片上延伸,直至在载玻片上相会,两种菌丝发生“亲密接触”,经过7-10天,取出载玻片,将载玻片的菌丝面朝上,在显微镜下观察,就会看到图1,图2和图3的现象。

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图2.放线菌溶解瓜类病害病原真菌菌丝(赵娟,2013)

图1-3中的“粗线”,是真菌菌丝,图上的“细线”,是放线菌菌丝。当“细线”缠绕在“粗线”上,或在“粗线”周围大量“堆积”时,被缠绕或包围的“粗线”就消失了,仅留下“细线”。“粗线”消失,实质是真菌菌丝被溶解了,表明放线菌具有“制造”能溶解真菌菌丝的“化学武器”。

图1显示,4种生防链霉素的菌丝能溶解棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌的菌丝。其中,娄彻氏链霉菌、蓝微褐链霉菌及卡那霉素链霉菌对大丽轮枝菌菌丝的溶解能力最强。

图2显示,3种生防链霉菌对2种西甜瓜病原真菌细胞壁有溶解能力。其中,密旋链霉菌的溶解能力最强。

图3表明,3种生防链霉菌对西洋参、人参病原真菌菌丝有溶解作用。其中,肉质链霉菌,球孢链霉菌及未定种链霉菌对西洋参锈腐菌丝的溶解能力很强。

真菌细胞壁为何能被放线菌溶解?

真菌的细胞壁由多种生物大分子构成:几丁质和纤维素线状大分子构成了真菌细胞壁的骨架,骨架中的填充物为β葡聚糖和蛋白质等生物大分子。N-乙酰葡萄糖胺单体连接起来构成几丁质大分子;葡萄糖通过β-1,4键连接起来形成纤维素;β葡聚糖是以葡萄糖为单体通过β键连接起来的大分子;蛋白质是以氨基酸为单体连接起来的大分子。这些生物大分子不溶于水,但若被各自对应的水解酶重新分解为单体,均能溶解于水。如几丁质酶能将线状几丁质大分子水解为乙酰葡萄糖胺单体;纤维素酶能将纤维素水解为葡萄糖分子;β葡聚糖酶能将线状葡聚糖大分子水解为葡萄糖;蛋白酶能将蛋白质大分子水解为氨基酸。当构成真菌细胞壁的生物大分子被上述水解酶分解成单体时,这些单体均能溶解于水,细胞壁就被“溶解”了。细胞壁丧失后,菌丝体内的水溶性原生质就流失了,照片上放线菌细丝缠绕和包围的“粗线”就消失了。

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3.放线菌溶解人参西洋参病原真菌菌丝(于妍华,2011)

放线菌溶解真菌菌丝的秘密化学武器:放线菌制造的各种水解酶

放线菌并不会轻易制造能分解真菌细胞壁的水解酶。这些酶不是放线菌生命活动必须的,为了节约资源,放线菌在非常需要时才制造这些水解酶。在生物化学研究中,上述水解酶通常被称之为“诱导酶”。当给放线菌提供的营养物质是能直接进入细胞的葡萄糖、氨基酸等小分子物质时,放线菌不合成各种水解酶;当给放线菌提供的营养物质是不溶于水、不能直接进入细胞的生物大分子,如几丁质、纤维素、蛋白质及葡聚糖,而不是能直接溶于水的小分子葡萄糖、氨基酸时,放线菌为了生长繁殖,不得不想方设法利用这些物质作为其生长的碳源、能源及氮源,就必须先将这些物质分解为小分子,如葡萄糖,氨基酸等。出于生存需要,放线菌在别无选择的情况下,被逼迫合成几丁质酶、纤维素酶等水解酶,以解决生存难题。能启动放线菌合成诱导酶的物质,如几丁质、纤维素等,就被称为“诱导物”。

图片1-3上显示的真菌细胞壁的溶解现象是否真是放线菌制造的化学武器所为?

我们设计了一个诱导产酶试验,证明或者鉴定真菌细胞壁的溶解确实是放线菌合成的诱导酶所为,准确回答供试生防菌能否制造可溶解真菌细胞壁的秘密化学武器。

首先,采用液体培养法培养病原真菌。将图1-3中的棉花、西甜瓜及人参西洋参病原真菌接种到真菌液体培养基中,培养1周左右,获得真菌菌丝体。培养结束后,过滤培养生成的菌丝体,用纯水洗涤多次,清除干净菌丝体上沾附的各种可溶性养分,将菌丝体烘干磨碎,制备成放线菌生长的唯一碳源。

其次,采用液体法培养放线菌。液体培养基中不加可溶性碳源和氮源等放线菌需要的养分,只将步骤1中获得的病原真菌的菌丝体粉末作为唯一碳源,作为水解酶合成的“诱导物”,加入液体培养基中;灭菌后,将待研究的几种放线菌接入液体培养基中,摇床培养1周,诱导放线菌产生几丁质酶、纤维素酶等诱导酶。培养结束后,测定培养液中各种水解酶的活性。如能检测到几丁质酶、纤维素酶等水解酶存在,或活性较高,则证明图1-3照片中能溶解病原真菌菌丝的几种生防放线菌确实能合成真菌细胞壁水解酶。

从上述诱导产酶试验发现:

1.供试西洋参及人参病原真菌菌体能诱导密旋链霉菌,肉质链霉菌,球孢链霉菌等9株生防链霉菌合成几丁质酶和纤维素酶,几丁质酶活性为7-12U,纤维素酶活性为6-21U(于妍华,2011)。

2.供试西甜瓜病原真菌菌体能诱导6株生防链霉菌合成纤维素酶、几丁质酶及葡聚糖酶,诱导合成的纤维素酶活性最高达9U。以木贼镰刀菌菌体为唯一碳源时,卡那霉素链霉菌合成的几丁质酶活性高达15U(赵娟,2013)。

3.供试棉花黄萎病原菌大丽轮枝菌的菌丝体能诱导4种生防链霉菌合成几丁质酶,纤维素酶,蛋白酶,β葡聚糖酶,β葡萄糖苷酶。其中,β葡聚糖酶、β葡萄糖苷酶活性为70-129U、31-37U(薛磊,2012b,2012c)。

真菌菌体诱导产酶试验证明,图1-3照片上观察到的真菌细胞壁溶解确实是供试生防放线菌的“杰作”,是放线菌通过其制造的特殊“化学武器”对病原真菌菌丝直接“攻击”的结果。显微镜下真菌菌丝消解现象与放线菌诱导产酶试验酶活性测定结果吻合,两个试验充分证明,我们筛选到的多功能生防放线菌确实具有尚未被研究者重视和广泛关注的抗真菌能力:酶溶抗菌功能。

酶溶抗菌,可能是放线菌活菌接入土壤后,土壤真菌显著减少的一种新发现的途径。

向土壤中接入放线菌活菌制剂后,放线菌菌丝在与真菌菌丝的“亲密接触”中,以构成真菌菌丝的生物大分子为诱导物,在其细胞内合成能溶解真菌细胞壁大分子的多种水解酶,并分泌到放线菌细胞外,附着在真菌菌丝上;构成真菌细胞壁骨架的几丁质、纤维素被水解成单体,细胞壁骨架崩溃;骨架中填充的蛋白质、β葡聚糖及β葡萄糖苷等多种生物大分子很快被水解成单体,真菌细胞壁就会彻底“溶解”,真菌的细胞结构就全面会崩溃,真菌死亡。

拮抗放线菌能通过产胞外酶溶解真菌菌丝体,减少土壤中的真菌数量,抑制病原真菌大量繁殖及侵染根系,进而减轻或防止土壤根系真菌病害发生。

放线菌通过抗生素拮抗真菌生长,已为大家熟知,但放线菌的酶溶抗菌作用并未引起研究者重视和关注。我们的相关研究从酶解角度揭示了生防放线菌对特定病原真菌的酶溶抗菌机制,为生防放线菌防病机理研究提供了新证据。

主要参考文献

1.薛磊.棉花黄萎病生防链霉菌的抗病促生作用及其机制研究[D].

  杨陵:西北农林科技大学,2012a.

2.薛磊,薛泉宏﹡,赵娟.大丽轮枝菌菌体对链霉菌胞外蛋白酶活性及抑菌效果的影响.

  棉花学报.2012b,24(1):78-84

3.薛磊,薛泉宏,卢建军.棉花黄萎病原真菌菌体对链霉菌4种胞外水解酶活性的影响.

  植物病理学报. 2012c,42(1):73-83

4.Juan Zhao Quan-hongXue Gang-gang Niu Lei Xue Guang-hui Shen Jun-zhi Du.Extracellular enzyme production and fungal mycelia degradation of antagonistic Streptomyces induced by fungal mycelia preparation of cucurbit plant pathogens.Annals of Microbiology.June 2013, 632:809–812  

5.于妍华,薛泉宏﹡,唐明.西洋参和人参病原真菌菌体对放线菌2种水解酶的诱导.

西北农林科技大学学报.2011,39(7):110-116

﹡通讯作者

 










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