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引言:
我们通常需要做基因或者其它DNA片段的定点突变来研究其功能,所以做好定点突变是分子生物学中的一项重要技术。今天,我将分享我自己做定点突变的经验,主要有两种方法,供大家参考。虽然Agilent推出很多快速定点试剂盒,但是主要原理类似。
方法一:一步法定点突变(直接以质粒为模板)
这种方法主要是用质粒为模板,所以为了扩增的效率,我们将正向引物和反向引物分开扩增,避免二聚体的产生。具体实验过程如下:
各20ul体系
18ul 混合物+2ul primer F
18ul 混合物+2ul primer R
在两个tube中配好反应体系后,置于PCR仪进行反应,反应程序为:
1. 98℃ 1min
2. 98℃ 10sec
3. 60℃(可调整) 20sec
4. 72℃ 根据质粒大小调整
steps 2-4 for 12 cycles
5. 72℃ 5min
6. 4℃
反应完成后,将两个反应体系混合后成40ul体系,并且补加适量的高保真聚合酶(如Q5),然后使用以上反应程序继续反应16 cycles。
得到的PCR产物加入1ul DpnI 酶和4ul的10*NEB cutsmart buffer消化模板质粒(原理是DpnI 酶只消化甲基化的DNA)置于37度反应1h。
取5ul跑胶看是否有条带,剩余的取部分做细菌转化,涂板。
12h后挑取3-5个克隆送测序。
注意点:1.设计引物时在突变位点两端各延伸20bp左右。
2.尽量用较小的质粒模板(可以将你的目的基因提前亚克隆到较小的载体)
3.避免使用有复杂序列的质粒做模板(如含有可包病毒的载体,含有重复序列)
方法二:搭桥法(线性DNA的定点突变)
这种也是比较常用的做基因定点突变的方法,主要原理是通过四对引物扩增出有重叠的序列,然后通过重叠延伸得到完整的序列。
这种方法的原理:
注意点:扩增的序列尽量不要太长,否则成功率不高。
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