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【实验方法】我是如何做定点突变的

已有 38944 次阅读 2017-6-6 22:30 |个人分类:实验方法|系统分类:科研笔记| 定点突变, 实验方法, 分子克隆


引言:

我们通常需要做基因或者其它DNA片段的定点突变来研究其功能,所以做好定点突变是分子生物学中的一项重要技术。今天,我将分享我自己做定点突变的经验,主要有两种方法,供大家参考。虽然Agilent推出很多快速定点试剂盒,但是主要原理类似。



方法一:一步法定点突变(直接以质粒为模板)

这种方法主要是用质粒为模板,所以为了扩增的效率,我们将正向引物和反向引物分开扩增,避免二聚体的产生。具体实验过程如下:


20ul体系

18ul 混合物+2ul primer F

18ul 混合物+2ul primer R

在两个tube中配好反应体系后,置于PCR仪进行反应,反应程序为:

1. 98             1min

2. 98             10sec

3. 60(可调整)     20sec            

4. 72          根据质粒大小调整

steps 2-4       for 12 cycles

5. 72            5min

6. 4


反应完成后,将两个反应体系混合后成40ul体系,并且补加适量的高保真聚合酶(如Q5),然后使用以上反应程序继续反应16 cycles

得到的PCR产物加入1ul DpnI 酶和4ul10*NEB cutsmart buffer消化模板质粒(原理是DpnI 酶只消化甲基化的DNA)置于37度反应1h

5ul跑胶看是否有条带,剩余的取部分做细菌转化,涂板。

12h后挑取3-5个克隆送测序。


注意点:1.设计引物时在突变位点两端各延伸20bp左右。

2.尽量用较小的质粒模板(可以将你的目的基因提前亚克隆到较小的载体)

3.避免使用有复杂序列的质粒做模板(如含有可包病毒的载体,含有重复序列)





方法二:搭桥法(线性DNA的定点突变)

这种也是比较常用的做基因定点突变的方法,主要原理是通过四对引物扩增出有重叠的序列,然后通过重叠延伸得到完整的序列。

这种方法的原理:


注意点:扩增的序列尽量不要太长,否则成功率不高。







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