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【实验方法】我是如何做分子克隆的

已有 17206 次阅读 2017-2-25 11:00 |个人分类:实验方法|系统分类:科研笔记| 实验技术, 分子克隆


分子克隆是一个实验室最基本,也是最重要的实验技术,我还记得曾经有位老师和我说过,做好分子克隆就可以轻松做好其它实验了,所以我的第一篇博文打算聊一下自己做分子克隆的过程和心得(也是一个被折磨过的灵魂)

分子克隆的过程大家都知道,我就直接展开到具体的每一步我是怎么做的:

cDNA获取:

通常,我们克隆一个基因的所需要的模板主要有几个来源:

1)  直接从体外培养的细胞抽取的RNA逆转录成cDNA后作为模板;

2)  从其它实验室的文库中索取你的目的基因cDNA,我知道的国内比较知名的当属厦门大学韩家淮课题组(百度搜索韩家淮cDNA索取),他们提供的cDNA很容易扩出来,本人已经索取过4-5个基因,在此顺便表示感谢;

3)  从其它实验室索取构建好的质粒,自己可以重新亚克隆到目的载体上,

4)  从addgene网站或者生物公司购买,当然需要付费,公司会更贵一点。

PCR扩增目的基因:

有人说这一步最重要的是引物设计,可是我不这么认为,其实扩增目的基因片段我从来不用引物设计软件(可能是我还没遇到难扩增的基因吧),因为引物大体序列已经固定(我通常设计长度就是22bp左右),如果模板是自己逆转录来的cDNA,我建议不妨试试巢式PCR。

酶切、连接和转化

我把这些步骤放在一起是觉得这些可以和PCR扩增在一天之内做完(PCR产物回收可以用PCR产物回收试剂盒),而且没有什么需要特别注意的细节,我大致是酶切2h(我们实验室使用的是NEB公司的限制性内切酶),跑胶后割胶回收。

回收产物做10ul连接体系(质粒和片段比例为1:3-1:10,质粒只需50ng),使用NEB的T4连接酶,室温反应1h就可以接着做转化了。

关于转化(连接体系加到感受态中冰上孵育30min,然后42度热激90s,再置于冰上1-2min),感受态是一个重要的实验材料,我们实验室根据protocol制备的超级感受态效果很好,大家如果根据自己的方法制备的感受态不太好用的话不妨试试这个protocol,我会贴在文末补充材料部分。

阳性克隆鉴定和测序

终于过夜长出克隆了,但是不知道哪个是真正插入了目的片段的阳性克隆,这时候我们可以选择的方法主要有两种:

1)  菌落PCR鉴定,我们可以使用基因片段扩增使用的引物进行菌落PCR鉴定,我一般采取的做法是先挑5个左右的单克隆用300ul左右培养基在1.5ml的EP管中摇到浑浊,然后吸取0.5-1ul作为模板进行PCR反应,大家可以使用2*taq mix,挺方便的。

2)  我们可以抽质粒后进行酶切鉴定,个人觉得这个方法时间太久。

挑出阳性克隆后保险起见可以进行酶切鉴定,但是根据我的经验如果条带比较亮的话可以直接送测序,等测序结果返回后使用NCBI的blast工具做比对确认目的片段是否正确插入到载体了。

到这里,整个载体构建过程算是完成了,当然这只是我个人做分子克隆过程中的操作流程和经验,有些地方写得不是特别详细,如果大家觉得有不对或者不清楚的地方欢迎指正或指出。

补充材料:


competent E . coli production(High efficiency )

The method is situable for molecular cloning transformation

This protocol is very effective and simple. Thefact that the cells are grown at low temperature greatly increase the OD rangeduring which the cells will prep up at high efficiency (Inoue et al., 1990).

Chill the following: >100 ml ice-cold Transformation Buffer (TB), centrifuge (GSA rotor), 500 mlcentrifuge bottle, and sterile freezing tubes (eppendorf tubes w/ good caps)

-Innoculate 250 ml SOB media (2 liter flask) w/ 10-12 colonies bacteria from a freshplate Shake well at 18°C - RT; grow bugs to A600 ~0.6 (ON-2 days). An OD of 0.6is ideal, but anywhere from 0.2 to 1.0 will work well. [Alternatively, trydiluting an overnight culture to OD=0.1 and then growing at RT for ~6 hrs.]

-Place on ice 10 minutes.

-Transfer to centrifuge bottle; spin 2500 x g ,10 min, 4°C.

-Resuspend pellet in 80 ml ice-cold TB; placeon ice for 10 min.

-Spin again 2500 x g, 10 min, 4°C.

-Resuspend in 20 ml ice-cold TB.

-Add DMSO, while swirling, to final 7 % (~1.4ml).

-Place on ice, 10 min. Dispense into freezingtubes (~0.5-1 ml ea)

-Freeze in liquid N2; transfer to -80°.

1 liter SOB: 20 g bactotryptone, 5 gbacto-yeast extract, 0.5g NaCl

Dissolve all in 950 ml ddH2O; add 10 ml 250 mMKCl; pH to 7.0 with NaOH

Adjust vol to 1 liter; Autoclave. Just beforeuse, add 5 ml sterile 2M MgCl2 per liter

TB perliter

10 mM PIPES Na salt 3.35 g

15 mM CaCl2 (Fisher) 2.2 g

250 mM KCl (Aldrich) 18.64g

55 mM MnCl2 (Aldrich) 10.9 g

Combine PIPES, CaCl2, KCl ; pH to 6.7; addMnCl2; filter sterilize

REFERENCES

Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H.(1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene96, 23-8.

SOB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中:
蛋白胨 20g
酵母提取物 5g
氯化钠 0.5g
1
mol/L 氯化钾 2.5ml
用水补足体积到1L。分成100ml的小份,高压灭菌。培养基冷却到室温后,再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。


SOC
培养基
成分、方法同SOB培养基的配制,只是在培养基冷却到室温后,除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外,再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶于足够水中,再用水补足到100ml,用0.22um的滤膜过滤除菌)。




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