小麦族多组学数据网站——设计基因组特异引物

昨天我们介绍了序列调取，今天我来说一说设计基因组特异引物。不过在这之前呢，还是简单的说一说我们的blast。

如下图所示可以进入，也可以直接输入网址进入http://202.194.139.32/blast/viroblast.php。这个网页的blast不是我们从头写的前端代码，而是来自全球最大的同性交友网站GitHub（https://github.com/MullinsLab/ViroblastStandalone）。实际上IWGSC也是借鉴了这个。这里有很多公开的源代码，是块学习的风水宝地。

关于blast要说的一点是：可以同时提交多条fasta格式的序列。以前我们也简单的说过fasta格式，其实就是如下图这样提交序列就可以。

另外一点要说的是blast结果的展示形式。我们常见的是是类似NCBI那种图形化的界面，实际上blast结果还支持其他形式的格式。我们有时候要成千上万条序列进行blast，同时还要对结果进行批量筛选。此时选择tabular格式就会很方便。下图中的参数大家可以多试试，学会了可以花式做blast。

关于blast的数据库和昨天获取序列的数据库是一致的。

第二部分我们要说一说设计引物

普通小麦是异源六倍体，而且重复序列居多，设计出特异好用的PCR引物就比较费时费力了。关于PCR今天我们介绍两款在线的网站，第一个是PrimerServer，可以按照下图展示的方式进入，也可以输入这个http://202.194.139.32/PrimerServer/。当然这个也是来自GitHub，相关的文章已经在bioRxiv预发表。引物设计部分还是使用的primer3，而使用blast进行引物特异性检测，进而筛选特异性引物。另外一个网站是BatchPrimer3（http://batchprimer3.bioinformatics.ucdavis.edu/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi），从域名上我们也知道来自UC Davis，这个网页版的接口是Frank M You写的，相关的文章已经于2008年发表在BMC Bioinformatics上。原本我们也可以放到我们网站上，但是不知道啥原因特别慢。所以我们暂时加了链接到UC Davis。这个网站可以设计多种类型的引物，有能力的小伙伴先学习使用，后面我们有机会再介绍，关于引物设计这一块，欢迎有经验的小伙伴给我们传授经验。插句题外话，很多时候，遇到一个问题，一定要养成首先查资料的习惯。很多时候你碰到的问题别人也会碰到，说不定有人就会将解决方法分享出来。这也许就是站在巨人的肩膀上吧。人类社会的发展离不开一代又一代的物质和文化（科学、技术？）的积累。

说的有点远了，我们继续回来介绍如何设计特异的PCR引物。还是要回到PrimerServer（http://202.194.139.32/PrimerServer/）。这个工具和我们常用的引物设计工具差异有点大。我也是仔细研究了使用说明才搞明白。建议可以点击下图所示的问号，了解具体的用法。

我们要设计引物，一首先得有序列。这里呢需要你指定序列在基因组的位置或者基因上的那一段，当然也可以自定义。下面我们分别来举例说明。

假设中国春基因组上在染色体1A上的这一个区间chr1A:61355084..61355117有一个SSR，我们想要特异引物来检测它。

如下图，这里需要输入3个数据即染色体名字，SSR在染色体上的位置，以及SSR的长度。这里SSR区间可以换成任意其他你想设计引物检测的目标区间。这里也可以一次设计多个目标区间的引物，另起一行输入3个数据即可。

上图还要注意右侧的设置，其中Region Type有三种类型，今天这个例子需要选择Target Region，这里强调的是PCR产物必须包括这段区间。如果你想要在在某个区间内设计引物，这里设计出的引物是随机分布在区间里的，这里强调的是引物只能指定的区间里设计。而For 3' End 则是指定引物的3'末端。另外扩增产物的大小也需要设置成合适的大小。这里因为是检测SSR，不宜过大。还要注意选择上方的数据库，如下图，这里选择中国春。

接下里需要设置引物设计的其他参数，如下图。这里和普通的基于primer3设计引物的参数是一致的，不再详细说明。一般默认就好，如果设计不出来引物，可以试着调整下。

在下面就需要设置blast以及筛选特异引物的参数，如下图。注意下图中的蓝色圆点，如果你要筛选特异的引物就选择Yes，否则就选择No。

最后一步是选择blast的数据库。这里选择中国春。选择之后就可以提交了。

提交之后，是引物的多少，时间不会太久。如下图所示，这里一共设计出82对引物（我们刚才提交了2个位点），需要对这82blast基因组序列，以便筛选出特异的引物。

首先看看下图展示的结果，图中顶部列出了目标位点的信息，这里一共设计出20对特异的引物。接下来就是一个示意图，红框圈出了目标区间，下面红色字体就是特异的引物。

下面这个就展示了引物1的详细信息。因为我们设计的是特异引物，所以底部的Possible Amplicons只有一个位点。

上图中注意有一个指向右边的手指，点开之后就是一张PCR产物在琼脂糖胶上的示意图，如下图。

拉到页面底部，就可以下载引物信息了，如下图。

下载文件的格式如下图所示。这里可以看到，我们刚才提交的第二位点并没有设计出特异的引物。

这样我们就可以合成引物了。其实根据基因设计引物和上面也是一样的，只不过需要将染色体的名字换成基因的名字。对应的区间也需要换成你想检测的区间。这里也支持自己提交序列，则需要输入你提交的序列的名字，以及开始位置和长度。

最后再强调一点，有时候设计出的特异引物的3'端只有一个碱基差异，可能不足以区分同源序列，可以考虑隔2-3个碱基引入一个错配，引入错配会导致扩增效率降低，可以适当提高循环数。

工具已经介绍给大家了，至于效果如何就要看大家自己的熟悉程度了。刀还是那把刀，有的人可以拿来宰牛，有的人连鸡怕都搞不定。今天先介绍到这里吧，后面根据反馈再介绍。