博主八月九号看到NgAgo新protocol（翻译成中文叫什么来着？），马上就手痒按新protocol做了一遍。需要指出的是，NgAgo不是博主的课题，博主不需要靠这个发文章，就是关注这个事情来着。博主向来非常尊重任何人的protocol，即使不认同，也会严格照做。但毕竟实验室不同，完全一样的条件的实验条件很难保证。并且博主明天就要回国学术交流去了，时间非常紧凑。但这次实验，博主可以保证以下几个传说中很重要实验条件是达到了，1）确定细胞无污染；2）无EDTA，并加了Mg2⁺。

先说结论吧，博主没有看到基因敲除。有人说博主，你做出来了说明韩水平高，做不出来说明你水平不够，何苦呢。还有有热心人向博主透露，韩的NgAgo是有用的，尽管他的文章里结论未必对，但可以看到1%左右的敲除（但博主没有看到数据，所以无从确定）。NgAgo这件事，大家看到国外的科学家不管观点怎样，至少敢贴数据。讨论的时候呢，也是只谈数据，不论个人人品。博主非常欣赏这种科研文化。所以，也来贴一贴。

首先，博主把自己的细胞送到德国的GATC公司检测是否有支原体污染。两天后，结果就出来了 －clean. 还给发了一个证书。

同时，博主也准备好了细胞，马上按着protocol做。以下是博主的T7EI结果。

博主用了公司合成的和自己T4 PNK (biolab)磷酸化的gDNA；两种不同的转染方法，Lipofectamine 2000和钙磷法；看了两个不同的基因位点，CCR5和AAVS1。红箭头是预期的产物条带。不幸的是，博主都没有看到NgAgo基因组水平的敲除。必须指出，博主用的是实验室现有的DNAase/RNAase-free的水，不确定PH是多少；博主也没有荧光标记的ssDNA,不知道gDNA转染效率怎样；也没有来得及用Fragment analyzer看看的gDNA的纯度怎样。

总而言之，NgAgo不像CRISPR一样，轻轻松松就能做出来的 - 如果有人能做出来的话。好了，博主要收拾行李去了。