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成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序
溶液配方:
1. 无糖无钙台氏液NT(=)
| MW(分子量) | mM | g/100mL | g/600mL | g/L | g/2L |
NaCl | 58.44 | 136 | 0.795 | 4.7687 | 7.94784 | 15.8957 |
KCl | 74.55 | 5.4 | 0.0403 | 0.2416 | 0.4026 | 0.8052 |
MgCl2 | 95.21 | 1 | 0.0095 | 0.0571 | 0.0952 | 0.1904 |
HEPES | 238.3 | 10 | 0.2383 | 1.4298 | 2.383 | 4.766 |
NaH2PO4.2H2O | 155.98 | 0.33 | 0.0052 | 0.0309 | 0.0515 | 0.103 |
去离子水 |
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| 100mL | 600mL | 1000mL | 2000mL |
2. 无钙台氏液NT(-):取NT(=)配制
| MW(分子量) | mM | g/200mL | g/300mL | g/500mL | g/400mL |
Glucose | 180.16 | 10 | 0.3603 | 0.5405 | 0.9009 | 0.7206 |
BDM | 101.1 | 10 | 0.2022 | 0.3033 | 0.5055 | 0.4044 |
3. 酶解液(E液):NT(-) + 胶原酶2 + 蛋白酶+BSA
30mL NT(-)+30mg collagenaseⅡ(以275U/mg计算) + 3mg protease + 30mg BSA
4. 酶解洗脱液(DE液):NT(-)+BSA
50ml NT(-) + 50mgBSA
5. 上机检测液(T液):NT(=)+ D-葡萄糖+ 1.8mMCaCl2
300mL母液 + 0.54g D-葡萄糖 + 0.06g CaCl2 (1mol/l,0.54ml)
6. CaCl2溶液: 1M CaCl2 0.2M CaCl2
复钙液 CaCl2溶液(0.2M):10 mL CaCl2=0.22gCaCl2+10mL 水
复钙终浓度为1.8mM,根据细胞悬液体积计算:
如细胞悬液体积40mL,含钙:40mL*1.8mM=0.072mM;每次加CaCl240μL,其中含钙 40*0.2=0.008mM;共加:0.072/0.008=9次,
0 — 0.2 — 0.4 — 0.6 — 0.8 — 1.0— 1.4 — 1.8mM
40mL + 40μL + 40μL + 40μL + 40μL + 40μL+80μL+80μL 0.2M CaCl2
实验步骤:
一、清洗心腔血液
1. SD大鼠腹腔注射5000 U/kg 的肝素,10 min 后, 用1% 戊巴比妥钠麻醉, 迅速开胸取心, 立即放入50mL氧饱和的 4℃无钙NT(-)液中,初步洗去心腔中血液,然后把心脏放入盛50mL氧饱和的 4℃无钙NT(-)液的培养皿中继续洗去心腔余血,同时持吸有NT(-)液的注射器并把主动脉套于有乳胶套的针头上,针头端部不能进入主动脉瓣,血管夹夹紧主动脉口,挂于langendorf灌流装置上,并用丝线结扎固定(如图A和B所示)。用50mL37℃无钙NT(-)液灌流心脏至液滴无色,流速为6 ml/min。
二、酶解心肌组织
2. 30mL 37℃酶解液灌流约33min至心脏变软,颜色变白。
三、洗脱消化酶,停止酶解
3. 消化酶洗脱液50mL37℃灌流约5min,取下心脏,置无菌40mL消化酶洗脱液。
四、复钙
4. 每隔5min.向溶液中加入分别40μL、40μL、40μL、40μL、40μL、80μL和80μL无菌0.2M CaCl2溶液。(此时Ca2+浓度为1.8mM)
5.单细胞收缩系统检测心肌细胞收缩功能或收集细胞2.5%戊二醛固定。
6. 上机检测液洗两次,暗室中负载Fura-2 AM Ca2+荧光探针染色,500μL 台式液加1μL DMSO溶解的Fura-2 AM Ca2+荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀,15min之后上仪器检测。
注意事项:
1. 心脏灌流液中不能有Ca2+,因为Ca2+抑制心肌细胞分离,减少细胞收益率。
2. 心肌细胞分离溶液中不要加入EGTA或EDTA,它们均是Ca2+螯合剂,它们会损害心肌细胞和抑制酶活性。
3.溶液的PH=7.35。
4. 如果动物小,心脏酶解时间应缩短。
5. 一次性吸管端部要钝化。
6. 双层纱布过滤心肌细胞。
7. 为了延长细胞的寿命,心肌细胞应该保存于4-8℃的环境中。
8. 可用0.4%的台盼蓝(用0.01M PBS配制)染色,用血球计数板计数并求得存活率。
9. 可用50g 离心5min沉淀细胞。
10. 高浓度酶溶液或长时间酶解都会损伤细胞质膜和膜整合受体。
11. 固定刚分离的心肌细胞可以先用洗脱液除去死去的细胞再固定。
12.所有溶液都要用O2饱和。
13.洗掉心脏血液的为4℃的O2饱和无钙台式液。
KB液 现用现配(不用过滤) (PH=7.3,KOH调节)(分离心肌细胞保存液,可以使心肌细胞保存约24h,且保持活性)
| mM | MW | g/L | g/100mL | g/200mL |
KOH | 90 | 56 | 5.04 | 0.504 | 1.008 |
L-Glu | 70 | 147.03 | 10.2991 | 1.0299 | 2.0598 |
KCL | 30 | 74.5 | 2.235 | 0.2235 | 0.447 |
KH2PO4 | 10 | 135.98 | 1.3598 | 0.13598 | 0.2719 |
MgCL2·6H2O | 0.5 | 203.3 | 0.1017 | 0.01017 | 0.02034 |
Hepes | 10 | 238 | 2.383 | 0.2383 | 0.4766 |
Glucose | 11 | 198.17 | 2.1799 | 0.21799 | 0.4359 |
EGTA | 0.5 | 380.36 | 0.19018 | 0.01902 | 0.03804 |
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