石蜡组织切片的HE染色

一、实验目的

苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法，简称HE染色方法，是常规病理制片最基本的染色，能够对正常组织和病理组织进行形态结构的观察。通过本实验的学习，了解HE染色的方法，学会观察正常组织和病理组织。

二、实验原理

1、细胞核染色的原理：苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

2、细胞浆染色的原理：伊红是一种化学合成的酸性染料，在一定条件下可使细胞浆着色。细胞浆的主要成分是蛋白质，为两性化合物，细胞浆的染色与染液的pH在胞浆蛋白质等电点（4.7—5.0）以下时，胞浆蛋白质以碱式电离，则细胞浆带正电荷，就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子，与胞浆蛋白质带正电荷的阳离子结合，使细胞浆着色，呈现红色。

3、分化作用：染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去，在进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。

4、返蓝作用：分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水出去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。

三、实验材料和试剂：

1、苏木精染液：

苏木精染液配制方法有多种，Harris苏木精染液是最常用的一种，其配方如下：

苏木精：2g

无水乙醇：20ml

硫酸铝钾：20g

蒸馏水：200ml

氧化汞：0.5g

冰醋酸：8ml

配制步骤：先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，再将这两种液体混合后煮沸（约1min），离火后向该混合液中迅速加入氧化汞，并用玻璃棒搅拌至染液变为紫红色（此时有大量气泡产生，故容器宜大，以防液体溢出），随即用冷水冷却至室温，然后加入冰醋酸并混匀，过滤后使用。

2、伊红染液

伊红染液有是水溶性和醇溶性两种，常用的为0.5%水溶性伊红染液，其配方如下：

伊红Y：0.5g

95%乙醇：100ml

3、0.5%盐酸乙醇分化液

36%—38%盐酸：0.5ml

75%乙醇：99.5ml

4、0.2%氨水（pH在7.5—8之间）

25%—28%氨水：0.2ml

蒸馏水：100ml

四、染色步骤与方法：

1、烤片：1小时，温度60℃（目的：使组织切片与载玻片贴合的更加紧密）

2、切片脱蜡至水：

       (1)二甲苯Ⅰ：10min

      (2)二甲苯Ⅱ：10min

      (3)二甲苯Ⅲ：10min

(4)无水乙醇Ⅰ：3-5min

       (5)无水乙醇Ⅱ：3-5min

      (6)95%乙醇Ⅰ：3-5min

   (7)90%乙醇：3-5min

       (8)80%乙醇：3-5min

      (9)75%乙醇：3-5min

(10)蒸馏水洗：5min

3、染色：

(1)木精染色：5-10min

      (2)蒸馏水洗：1min

(3)0.5%盐酸乙醇分化：10s/10 to 20 quick dips

(4)蒸馏水洗：2min

(5)0.2%氨水返蓝：约40s

(6)蒸馏水洗：2×1min

(7)0.5%伊红染色：5min

(8)蒸馏水速洗

4、脱水、透明、封固

      (1)80%乙醇：3min

      (2)90%乙醇：3min

       (3) 95%乙醇：3min

       (4) 无水乙醇Ⅰ：5min

      (5) 无水乙醇Ⅱ：5min

      (6) 二甲苯Ⅰ：5min

      (7) 二甲苯Ⅱ：5min

       (8) 二甲苯Ⅲ：5min

      (9) 中性树胶封固

五、染色结果

细胞核呈蓝色，细胞浆呈粉红色至桃红色，胶原纤维呈淡粉红色，红细胞呈较鲜艳的橘红色。钙盐、细菌菌落呈蓝色或紫蓝色。

六、注意事项

1、染色前，切片脱蜡应彻底。若脱蜡不彻底，则影响着色。

2、染色时间与染液的新旧程度有关，不能一成不变。新配制的染液着色力较强，染色时间可适当缩短；反之，则适当延长。伊红染色程度应以苏木精对核的着色程度为参照标准，掌握其染色时间，以达到对比鲜明为宜。

3、伊红染液的pH值不能低于细胞核染色体等电点（pI=3.3），否则染色体也可表现碱式电离带正电荷，而被伊红染液染色，使细胞浆与细胞核区分不开。因此伊红染液的pH值应小于胞浆蛋白等电点，而大于胞核染色体等电点，在3.6-4.7之间。

4、掌握好分化程度，分化时要认真观察，精心操作，观察切片由深蓝色变成红色或粉红色时，立即将切片置入自来水中终止分化。

5、封固用的中性树胶的浓度要适宜，避免产生气泡。如中性树胶过稀，容易溢出盖玻片的周围，且树胶内的二甲苯易挥发，树胶干燥浓缩后可产生气泡。如中性树胶过浓稠，滴后不容易扩散，有气泡不易排出。若封固后气泡存留，既影响切片观察，又影响切片保存。因此有气泡产生时，应轻轻按压盖玻片，将气泡驱除。

6、脱蜡用二甲苯应该经常过滤,并定期更换新液，脱蜡时应避免将二甲苯过多地带入酒精中出现云雾现象。

7、为了加速脱蜡过程，可将切片预先进行加温，再行脱蜡。

8、苏木素染色时间的长短，主要依据气温的高低，染液的新旧，组织的差别以及组织所使用固定液不同而有所区别，很难提出一个确切的时间，一般先染5-10min，取出后返蓝，镜下观察，若染色不足，可延长染色时间。

9、苏木素使用一段时间后，表面易出现亮晶状氧化漂浮物，必须勤过滤，否则粘附于组织上时不易去掉，苏木素液颜色为灰蓝色时应弃掉换新液。

10、盐酸酒精分化是苏木素染色的关键，分化时间长短很难确切说出，只有凭经验来控制操作，分化时细胞核以外成分首先脱色，其次胞核开始脱色，分化时应随时在显微镜下观察，使组织着染适度，分化鲜明，一般在盐酸酒精中将组织分化成淡粉色为宜。

11、分化适度的切片，应立即用水冲洗，否则残存在切片上的盐酸酒精仍然进行着脱色作用，冲洗时水流不宜过大，以防脱片，冲洗时间不应少于10min。

12、为了缩短冲洗时间，可用返蓝液，但必须充分水洗，否则影响伊红的着色。

13、伊红应该淡染，以免喧宾夺主，应该色彩对比适当，鲜明艳丽。

14、组织切片的脱水，透明等必须彻底，否则切片易呈云雾状，难以镜检。脱水用酒精必须定期检查更换，以保证有效浓度。

15、切片有脱落现象时，可用0.5%稀火棉胶液防止，切片脱蜡至纯酒精后，如火棉胶液浸半分钟，取出稍干，如80%酒精中硬化火棉胶，然后入水洗，进行染色。

0.5%火棉胶配方：

纯酒精    90ml

乙醚    90ml

5%火棉胶液    20ml