该试验的思路源自于此http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=683543&do=blog&id=871905 

试验的具体方案：

外源性补充类活性氧即二氧化氯溶液对肿瘤的影响研究

1 体外细胞实验

1.1 二氧化氯对肿瘤细胞的作用

1.1.1 用MTT法检测二氧化氯对肿瘤细胞（见下图）和正常细胞（见下图）活性的抑制作用。（二氧化氯浓度100ppm，1000ppm，2900ppm，高浓度（2%），pH值分1、4、6；高浓度添加DMSO(1:1)）

1.1.2 用AV/PI双染法计算二氧化氯针对肿瘤细胞的凋亡和坏死作用，研究二氧化氯对肿瘤细胞的具体杀灭作用。

1.1.3 利用Comet Assay分析二氧化氯对肿瘤细胞DNA damage。

1.2 二氧化氯对肿瘤细胞的作用机理

1.2.1 用HPF、mitosox red 结合流式细胞仪监测二氧化氯处理后的肿瘤细胞ROS水平。

1.2.2 用H2DCF-DA探针观察二氧化氯处理后的肿瘤细胞ROS水平，连续观察绘制变化曲线。

1.2.3 用二氧化氯处理后，5分钟内再分别用维生素E和过氧化氢酶处理后，再分别观察肿瘤细胞ROS水平，检测使用抗氧化剂是否抑制二氧化氯依靠氧化作用杀灭肿瘤细胞。

1.2.4 利用BODIPY 581/591 C11观察肿瘤细胞的氧化应激反应。

2 二氧化氯对肿瘤作用的体内试验

2.1 动物模型建立：C57BL/6小鼠200只，分对照组、药物高剂量组、药物中剂量组、药物低剂量组。

2.2 二氧化氯对动物体内肿瘤的作用：瘤内注射，7天一次，1-50天，对照组与二氧化氯浓度组（现配的高浓度添加DMSO(1:1)）。

2.2.1 每日测量肿瘤大小、动物体制、动物死亡情况，绘制肿瘤生长曲线和动物生存曲线。

2.2.2 选择1h、24h和72h肿瘤组织，进行HE染色，观察肿瘤病理情况。

2.3 免疫组化检测肿瘤组织。

2.3.1 Luminex技术（液相芯片检测技术）分别检测（注射后3天）肿瘤组织（和对照组）PD-1，IFN-γ，TGF-β，IL-2，VEGF，IGF-1，IL-1β和TNF-α蛋白含量。

2.3.2 分别检测对照组和试验组（注射后1天、3天和6天）肿瘤组织CD8+,CD4+,CD3+ TIL NKT 细胞数量。

2.3.3 在肿瘤接种后，每周一次用抗体mAbs消除CD4,CD8,NK细胞，观察缺乏免疫细胞的情况下，二氧化氯对肿瘤组织的影响。

（目的：观察用抗体消除CD8等T细胞前后，二氧化氯注射对于肿瘤的影响，来判断二氧化氯是否具有ROS的功能如激活T细胞免疫来促进肿瘤缩小）

2.3.4 在建立肿瘤模型的过程第3、6和9天腹腔给抗体mAbs消除CTLA-4/PD-1，注射后的若干天（比如21天），测量肿瘤细胞的大小。

（目的：观察缺乏与否肿瘤免疫T细胞负向调控通路CTLA-4/PD-1对二氧化氯对肿瘤细胞作用的影响，来判断二氧化氯是否具有ROS的功能如激活T细胞免疫来促进肿瘤缩小，此外可以和CTLA-4/PD-1做一个对照）

For depletion of subsets of T and NK cells, immune cellswere depleted (by intraperitoneal injection of 500 mg of either GK1.5, YTS 169,PK-136, or isotype control, Bio X Cell) 2 days before tumor inoculation and 60%oxygen treatment, preventing attack by T or NK cells on tumor cells. Tomaintain immune cell depletion, mAbs (250 mg) were given intraperitoneallyeach week until assay completion (21 days). Rat immunoglobulin G (IgG) isotypecontrols were given to controlmice at the same dose. For CTLA-4/PD-1 dualblockade, mAbs against CTLA-4 (9H10, Bio X Cell) and PD-1 (J43, Bio X Cell)were injected (500 mg) intraperitoneally into tumor-bearingmice ondays 3, 6, and 9. Mice were treated 二氧化氯注射 from days 3to 21 or 对照组 until assay completion at day 21.

2.4 使用二氧化氯溶液注射正常组织，观察情况。

2.5 使用静脉注射，观察情况。