高粱SnRK2家族基因在非生物逆境应答和生长发育中的功能解析

山东省农业科学院蔬菜花卉研究所  李利斌，E-mail: libin224@126.com.

项目摘要:植物SnRK2基因在非生物逆境和ABA应答及生长发育过程中具有重要功能，但在高粱中缺乏研究。高粱作为重要的粱饲兼用作物和能源植物，具有强大的抗逆适应能力，使其在边际土地生产中日益受到重视。高粱的基因组较小、序列重复水平低、和重要农作物玉米、甘蔗亲缘关系近等特点，使得它在植物抗逆研究和禾本科及C4植物比较基因组学研究中具有重要地位。但是目前有关高粱功能基因组学的研究、抗逆相关基因的克隆和功能分析十分欠缺。本项目拟在高粱SnRK2基因生物信息学解析的基础上，从全基因组水平克隆高粱的SnRK2基因，并从基因的结构和遗传进化、基因的表达的组织和发育特性、表达产物的亚细胞定位和活性分析、基因在杂种和亲本及抗逆性不同的材料中的差异表达、基因的启动子和顺式调控元件分析、基因在不同逆境和激素ABA处理条件下的表达谱分析、基因遗传转化和转基因植株的表型分析、生理生化分析及分子验证等方面对高粱的SnRK2基因进行深入系统的研究，阐明高粱SnRK2基因在非生物逆境应答和生长发育中的功能，为揭示高粱抗逆遗传机理、促进禾本科作物抗逆整体水平的研究和利用SnRK2基因进行高粱等重要农作物的遗传改良奠定基础。

研究意义

1）  高粱是我国重要的粮食和饲料作物，也是日益重要的能源植物。它抗旱、耐盐碱、耐瘠薄能力强，适应性广，具有高光效和生物产量高的特点，在干旱半干旱地区和边际土地农业生产中日益受到重视。而且，它是典型的C4植物，基因组相对较小，基因序列重复水平低，与玉米和甘蔗的亲缘关系近，是进行C4植物基因组结构、进化和功能研究的模式植物。目前，高粱基因组测序已经完成，但是有关高粱功能基因组学的研究还很欠缺。进行高粱功能基因组学研究，对于揭示高粱环境广泛适应性的分子遗传机制，促进其它重要禾谷类作物抗逆功能基因组学的研究具有重要理论意义。

2）  植物SnRK2基因在干旱和盐胁迫应答、ABA信号转导、矿质营养吸收以及生长发育过程中具有重要功能，但是有关高粱SnRK2基因功能的研究十分欠缺。

随着我国工业化和城市化进程的日益加速，耕地和水资源日益紧张，粮食和农产品供给压力日益加大。而且，近年来我国气候异常现象日益加剧，干旱等灾害性气候发生频繁。生产上对农作物的高产、稳产和适应性提出了更高的要求。如何在水土资源有限的条件下增加粮食和农产品生产，是我国迫切需要解决的一个重大课题。这就需要对现有的重要农作物的抗逆性进行遗传改良，而农作物抗逆性状形成和表达的分子机理的研究是作物抗逆遗传改良的基础。因此，研究高粱SnRK2家族基因在非生物逆境应答和生长发育中的功能，对于揭示高粱抗逆分子遗传机理，利用SnRK2基因进行高粱和其它重要禾谷类作物的抗逆遗传改良，从而提高水土资源利用效率，保障粮食等农产品供给，具有重要的理论价值和实践意义。

研究现状

1）高粱的抗逆研究 

高粱是一种综合抗逆性和适应性极强的作物，耐旱、耐盐、耐贫瘠、耐热、耐涝，光合能力强，水分利用效率高，生物学产量高，特别适合在边际土地上和干旱半干旱地区种植。它不仅是重要的粮饲兼用作物，而且也是日益重要的能源植物。由于其基因组较小（730Mb），序列重复水平低，和玉米、甘蔗等重要农作物亲缘关系近等特点，高粱是C4植物研究和农作物抗逆机理研究的模式植物。人们对高粱的抗逆性从QTL和基因表达等方面进行了研究，发现持绿QTL单独可以减轻花后干旱胁迫造成的叶片衰老，干旱诱导表达序列SbEST8在耐旱性不同的品种中差异表达，高粱基因组测序和分析的结果显示其抗旱性可能与最近发生的基因和MiRNA的复制有关，mtlD的转基因高粱提高了抗旱耐盐性，高粱的DERB基因可能受多种激素调控表达，生长素相关基因和谷胱甘肽转运蛋白基因与高粱的抗逆性相关。另外，对高粱在干旱脱水、盐胁迫、冷胁迫以及和ABA 、茉莉酸甲酯、水杨酸和ACC处理条件下的基因转录表达谱进行了分析，对高粱的MiRNA及其靶基因进行了预测分析，发现了一大批与抗逆有关的基因和MiRNA。但是目前国内外有关高粱抗逆基因克隆和基因功能的研究十分欠缺，远落后于水稻和玉米的研究。高粱全基因组测序的完成，为开展高粱功能基因组学研究和重要基因挖掘利用研究奠定了基础。加强高粱抗逆功能基因的克隆和功能的研究，不仅有利于揭示高粱抗逆的分子机理，而且能够促进禾本科其它重要农作物的抗逆分子生物学研究，为农作物的抗逆分子育种改良奠定基础。另外，目前高粱的种植利用尽管日益受到重视，但是有关高粱育种和产量潜力改良的研究还很落后，急需跟上。开展高粱功能基因组学的研究，也有利于发现与产量相关的功能基因，从而促进高粱品种产量的分子育种改良。

2）植物SnRK2基因在非生物逆境和ABA信号应答中的功能

植物SnRK2基因是一类与酵母中的SNF1同源的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（SnRK）。在模式植物拟南芥、水稻基因基因组中各有十个SnRK2基因，在玉米基因组中报道有11个SnRK2基因（Huai等，2008）。本项目申请人通过生物学信息学挖掘，在玉米的基因组中发现了三个新的SnRK2基因, 在高粱基因组中解析出10个SnRK2基因。目前研究表明，植物SnRK2基因在干旱、盐胁迫和ABA信号应答过程中及硫的吸收等方面具有重要功能。PP2C-SnRK2复合体在植物ABA信号应答途径中处于核心地位，AtSnRK2.2、SnRK2.3、AtSnRK2.6/OST1和水稻的SAPK6可通过和上游的PP2C蛋白互作和磷酸化下游的ABF/bZIP类转录因子和离子通道SLAC1来响应ABA和逆境信号，调控植物气孔开闭。拟南芥突变体分析和表达谱分析表表明SnRK2基因在渗透胁迫应答中具有重要功能，而表达谱分析和渗透胁迫下的蛋白分析也表明水稻的SnRK2基因在盐胁迫和渗透胁迫过程中具有重要功能，转基因研究表明OsSAPK4在抗盐方面具有重要功能，小麦的SnRK2.4、SnRK2.7和SnRK2.8转基因植株提高了对渗透和干旱胁迫的抗性，小麦的W55a参与干旱等多种逆境应答，AtSnRK2.3和衣藻的SnRK2.1基因在缺硫应答方面具有调节作用，而AtSnRK2.7/SnRK2.8在干旱应答方面具有重要功能，而AtSnRK2.9在缺磷条件下诱导表达。AtSnRK2.10和蚕豆的AAPK可通过与磷脂酸结合和磷酸化脱水素来调控逆境应答过程。另外，SnRK2也可自身磷酸化，而且在ABA处理和渗透胁迫下的磷酸化机制有所不同。最近研究表明，植物SnRK2基因可被钙感受器蛋白负向调节。申请人通过分析高粱SnRK2的蛋白基序发现多个SnRK2蛋白存在豆蔻酰化位点，可能SnRK2蛋白和SnRK1一样，也受豆蔻酰化的调节。申请人通过分析拟南芥、水稻、玉米SnRK2基因的上游序列发现，在多个植物SnRK2的上游调控序列中存在热胁迫应答元件HSE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA、水杨酸应答元件TCA等调控元件，说明SnRK2基因也可能参与植物激素茉莉酸甲酯、水杨酸和热胁迫的应答过程。这些过程在现有SnRK2研究中未见报道，值得探讨。

3）植物SnRK2基因在生长发育中的功能

已有研究表明，植物的SnRK2基因不仅在在非生物逆境应答中具有重要功能，而且在生长发育发面也具有重要功能。例如，AtSnRK2和AtSnRK3在种子萌发和根系生长发育中具有重要功能；AtSnRK2.6/OST1在调控糖代谢和植株生长发面具有重要功能；AtSnRK2.9在植株发育、生物量和产量形成方面具有重要功能（Hu，2009）， AtSnRK2.8在代谢方面具有重要功能，可以调控14-3-3蛋白和糖代谢的重要酶类；小麦的SnRK2.7参与了碳水化合物代谢和促进光合系统II的功能；蒺藜状苜蓿的SnRK2基因MtSK1在体细胞胚胎发生过程具有一定功能。这些研究在重要农作物水稻、玉米、高粱中尚未见报道。加强农作物SnRK2基因在生长发育中的功能研究，有利于作物产量性状的遗传改良。

项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题

研究内容：

1) 利用PCR的方法从全基因组水平克隆高粱SnRK2基因的全长cDNA，并与玉米、水稻等的SnRK2基因进行遗传进化分析；

2) 利用BD Genome Walker 方法克隆高粱SnRK2的基因组序列和启动子序列，并进行顺式调控元件分析和启动子活性分析；

3）高粱SnRK2基因表达的时空特点及在不同非生物逆境（干旱、盐、冷、热胁迫）和缺磷、钾、硫条件下的表达情况；

4）高粱SnRK2基因在不同激素（ABA、水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯）处理条件下的表达情况;

5) 高粱SnRK2基因表达产物的亚细胞定位情况；

6）高粱SnRK2基因在高粱亲本和杂交种中表达情况；

7）高粱SnRK2基因的原核表达、表达产物的活性分析及抗体制备；

8）高粱SnRK2基因转录后水平蛋白的表达情况分析；

9）高粱SnRK2基因过量表达载体的构建和遗传转化拟南芥、高粱；

10）转基因植株的表型分析，生理生化分析及分子水平的检测，验证其功能。

利用转基因植物研究高粱SnRK2基因对生长和发育的影响。

研究目标：

1)从全基因组水平克隆高粱的SnRK2基因，明确这些基因的结构和遗传进化关系；

 2)明确高粱SnRK2基因的时空表达特点，在不同逆境和激素处理条件下的表达情况；

3）阐明SnRK2基因在逆境应答和生长发育中的功能。

拟解决的关键科学问题:

高粱基因组中的SnRK2基因的数目、基因结构和进化关系是本研究的首要问题；这些基因时空表达特点，在不同逆境胁迫和激素处理条件下的表达如何，与抗逆和生长发育的关系如何，它们具有怎样的生物学功能是本研究要解决的关键问题。