上图所示为激光共振能量转移的原理图，荧光分子间距离小于一定范围时，激发donor的激光会通过能量的共振转移把能量传递到acceptor分子，这种传递与距离有公司可以描述。能量转移的效率可以用donor和acceptor的荧光信号大小计算，反应在波谱图上就是高斯峰的大小。

单分子荧光共振能量转移的仪器组装的技术流程可简单罗列如下：

（1）氮气工作台的安装与实验室氮气源的安装。因单分子仪器需要高度的平面稳定性，所以我们需要氮气的cushion作用保持系统的稳定性。

（2）倒置显微镜的安装。为使荧光信号可以传递到CCD照相机，我们要打开显微镜侧面的插口使荧光信号可以通过探测光路。

（3）安装dichoic和其他各种光学透镜。 分开为红，蓝，绿三色荧光，我们需要dichoic mirror成梯子形排布使它们照射到照相机pixel的不同位置。

（4）安装高能激光器。我们需要大概100mW的激光器去激发样品的荧光分子，激光器需要有序固定排列在氮气工作台上。

 （5）入射光路的调节。我们要保证入射激光始终聚焦，并且有最小的发散。

 （6）安装激光自动开关装置。在实验的过程中，我们希望可以自动控制机器的开关。因此，我们需要安装一个机械的激光开关装置，使操作者只要按一下鼠标，激光可以自动关闭。

 （7）自制显微镜位置调控平台。这种平台没有商品化，需要自制， 这里需要一些简单的机械加工。

 （8）安装三维的镜头调控装置。该装置有三层，需要依次安装固定。

 （9）安装探测光路。需要把各种mirror和lens固定并调整角度。并且要保证激光始终平行照射到这些镜头上。

 （10）调整入射光的角度保证全反射可以发生。单分子FRET的发生依赖于激光的全反射，这样只有表面的分子可以被激发，从而背景可以最大化限度的降低。

  （11）安装EMCCD。EMCCD是目前最灵敏的照相机，其工作始终保持在零下-72，我们需要保证从探测光路来的荧光可以进入EMCCD。

  （12）连接各种shutter与EMCCD到计算机。我们需要计算机控制所有的重要光线部件，这样可以保证数据的获取速度快并且操纵方便准确。

  （13）安装新的电脑硬件使其可以单独控制EMCCD。

  （14）安装电脑软件计算机可以使其与各种光学部件交流，并对其进行控制。

  （15）数据的采集与分析。数据采集看似简单，然而在实际操作中需要非常多的技巧。如果不掌握这些技巧，任何人都不可能得到好的数据。这里需要很多的培训，这也是本项目书中多次强调的地方。正因为这些技巧的存在，使那些没有单分子研究背景的人永远无法踏入这一领域。

上图左面是单分子荧光共振能量转移的激发光路图，右面是采集光路实图。在激光光路上我们有几个调光元件，这样可以精细调节照射到样品表面的激光强度。在采集光路，我们用分光镜讲不同波长的光分开。    

单分子荧光共振能量转移的整体仪器图。