以图位克隆技术克隆基因，分子标记的开发与筛选是关键步骤之一，差异明显的分子标记在数据统计上一清二楚，不容易出错，如果能够以琼脂糖胶来分辨，更是极大的节约了实验时间。现在随着高通量测序技术的发展，获得一个物种完整基因组变得越来越容易，因此分子标记的开发也不再是什么难事。结合这几年的研究工作，来说一下目前最经常用到的SSR和InDel分子标记的开发与筛选，自己的一些心得体会，以玉米为模式生物基因克隆过程中标记的开发为例。

先说个题外话，很多刚刚接触分子标记的人，常常会问到底什么是分子标记？多态又是什么？举个简单例子，你出门去某个地方，查询得知，要经过一座大桥，一个公园，一个别墅小区，一栋99层的大楼，这些大桥、公园、小区、大楼就是你到目的地前首先要找标志性建筑，在基因克隆上就是所说的分子标记。那么什么是多态呢？所谓多态其实就是差异性。月季花应该都见过，有白色的、有黄色的、有红色的，这些颜色上差异就是多态，只不过这个多态是形态学上的多态。如果说到这里还不是很明白，不用着急，当你亲手做一段时间后，自然就会明白什么是分子标记了。

SSR（Simple Sequence Repeats）简单重复序列，又称之为微卫星DNA，在拟南芥、玉米、水稻、小麦、烟草等植物中非常丰富，因此被广泛用来基因定位、亲缘分析等。其串联重复的核心序列为1—6 bp，重复单位数目不一样，高度多态性就是来源于其串联数目的不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，就能够显示出差异性。

克隆一个基因首先要对其粗定位。在玉米中，如果一个基因在哪条染色体上还未知，可先进行全基因组的筛选。我要克隆的基因，前人已经粗定位于4号染色体两个分子标记之间，但这个定位并不准确，只是一个参照。所以当我接手这个基因后，首先在这两个标记上下游延伸了40M的距离，在玉米数据库MaizeGDB上重新挑选了一些SSR标记，对其区间进行了确认。

对这个基因粗定位了以后，此时数据库上前人开发的标记已不能满足定位需求。根据粗定位区间，在其内挑选了一些BAC，在这些BAC上开发SSR标记。BAC的序列可以在MaizeGDB或者NCBI上获取。

BAC序列截图：

在获得这些BAC序列后，接下来就要找到SSR的位点在哪里，有很多工具可以利用，网上有在线的SSR序列分析。我一般都是使用SSR Hunter1.3进行SSR位点的搜寻，该软件简单实用，参数设置只有两个：构成重复元件的核苷酸数最多是，重复次数最少为。可根据对标记的需求来设置。

SSR Hunter1.3界面：

  将得到的BAC序列输入到SSR Hunter1.3左边方框中，设置好参数，点击“SSR位点搜索”就可以了。

搜索结果如下，点击保存。

acaaatgacaaacatggtgaacgaaatgcaaaatcagataaggcaagaatgccaggaaatgcgtcaagaccggctggagatgcgtcaagaaatgaggcaagcacggttggaaagacaacagcaccaccacccaccaccaactccaccaagATATATATATATATATATATtactatttgtaagacctaaatgttactttagttagtagttaatattttactattttaggaataataataaggtctattaaccctatgtgttgctatgcatcatgctgagatttttatttatgcatacattcggagacaacattattatac

红色字体即为SSR位点，在得到这些SSR位点后，就可以直接拿来设计引物，引物设计软件很多，我一般习惯使用NCBI的在线引物设计，因为玉米的基因组序列已存在，当其设计好引物后，会自动在数据库里搜索一翻，如果匹配到其他位点上，给出的引物报告单会自动注明，可以选择是否用该标记。

SSR引物设计时PCR产物选择多大呢？我们一般都是80-150bp，这样扩增时不但丰度很高，扩增后信号很强，避免了非特异扩增，而且在选择电泳时，我们以小板胶来跑，EB染色，比设计300-500bp，用大板胶跑，银染节约了很多的时间。

有多态的分子标记：

小板胶来跑，EB染色电泳图：

大板胶来跑，银染色电泳图：