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分选注意事项---以Aria为蓝本
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一、特别注意
1. 安全性问题：由于在分选过程中，样本可能通过液滴震荡产生气溶胶，所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本，也不接受含放射性生物样品。
1. 安全性问题：由于在分选过程中，样本可能通过液滴震荡产生气溶胶，所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本，也不接受含放射性生物样品。
2. 应知道细胞的大小与形态，以便选择分选用喷嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的1/5，至少小于1/3。细胞的形态也会影响了分选的结果，理论上越接近于球形的细胞，分选过程中的剪切力对细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴，以减轻分选过程对细胞造成的伤害。
各种细胞的建议浓度和所用喷嘴如下表。
Table 1 细胞种类和浓度、喷嘴的选择
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细胞种类 |
浓度 |
喷嘴 |
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Lymphocytes, thymocytes or splenocytes (直径8-12 μm) |
8 - 12 × 106 /ml |
70μm |
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Activated lymphocytes, smaller cell lines (直径12-20 μm) |
7- 9 × 106 /ml |
85 μm |
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Large adherent cell line (直径>20 μm) |
5 - 8 × 106 /ml |
100μm |
二、样本制备
1. 样本制备基本流程：
获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度（参考Table 1）→过滤细胞→移入流式管→避光置冰上运至分选室→上机检测并设定分选条件→分选细胞→上机回测，检测纯度。
注：分选前的细胞一定要过滤过（一般用300目滤网），否则会堵机器的。
2. 分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同，但需要注意以下几点：
a） 保证样本的无菌状态，因为分选得到的细胞还要继续培养；
b） 不能使用固定剂固定细胞，因为活细胞经固定剂处理后即死亡；
c） 保证上机样品为单细胞悬液；
d） 准备充足的细胞，详见Table 1；
e） 建议分选上样管中的缓冲液使用含2% FBS的PBS，普通培养基中的酚红可能会干扰分选；若用培养基的话，颜色不能太深，血清浓度不能超过2%，否则粘性太大影响分选。
f） 如细胞分选后需再次培养，请准备含血清的收集管，在分选前交操作员。建议在5ml离心管中加入1-2ml血清及其它必需组分，保证分选完毕时血清浓度大于5%；
g） 如要分选GFP等转染的样品，请提供未经转染的相同细胞为阴性对照；
h） 如要做多重荧光染色标本的分选，请提供各种单一荧光染色的标本；
i） 如要去除死细胞，在不影响后续实验前提下，可以加入7-AAD或是PI；
j） 快速简便的样本处理有利于分选：处理好的样本尽快上机，分选好的细胞尽快下一步实验，如果要分选多个样本，建议一次处理一个，估计可能的上机时间后，再处理第二个样本。
四.常见问题
Q1. 上机样品需要溶在何种溶液中？是否可以就直接放在原本培养的培养基中？
Ans: 建议不要放培养基中，因为Phenol Red可能会影响分选的结果，可先尝试使用含2%FBS 或BSA的PBS作为分选缓冲液。如要求更好的细胞存活率，按分选细胞的不同，选择不同的分选缓冲液。
1. 淋巴细胞（HBSS配方中的阳离子可增进细胞的生存力。如果这些细胞并非易于群集细胞，可以选用没有EDTA的缓冲液）。
a) 1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and Mg2+)
b) 1× HBSS (without phenol red) with 1% BSA
c) 0.5% - 2% BSA in PBS(without Ca2+ and Mg2+)
2. 贴壁细胞（以Trypsin处理后去准备单细胞悬浮液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，以适量含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬浮液。离心后，用分选缓冲液调整细胞浓度。如果需要的话可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免细胞重新黏聚）。
a） 5 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and Mg2+)
b） 0.5-2% BSA in PBS(without Ca2+ and Mg2+)
3. 含有高比例死细胞的样本（这些配方可减少因死细胞释放出来的DNA所造成的细胞黏聚现象。）
5mM MgCl2, 1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0), 25-50 μg/mL DNAase I and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and Mg2+)
4. 建议询问有经验者（使用相同细胞进行过分选）的分选缓冲液配方
Q2. 如果细胞要再培养，会污染吗？
Ans: 分选所用的所有溶液都经高温高压灭菌，流式分选仪管路使用70%乙醇定期清洗，仪器所在房间在每次分选前紫外灭菌，最后在细胞培养基中加入抗生素，可将污染机率降至很低。
Q3. 如果我想在分选后拿到1×106的细胞我应该一开始准备多少细胞去做分选？
Ans: 假设你要的细胞只占总数的10%，则你所需准备的细胞数如下公式: 1×106=10%× 50%回收率× 20×106(起始细胞数)，所以你需要准备2×107细胞。高速分选、纯度模式(purity vs. yield mode)、部分细胞黏附于上样管壁、部分细胞用于样本分析、长时间分选过程中细胞的死亡等等，对会降低回收率。50%回收率是一个一般的参考值。
Q4. 通常做一次细胞分选需要多久时间？
Ans: 分选的过程有三个步骤，分别为设定分选区域、分选及分选后的分析。设定分选区域约需15-20分钟。分选的时间决定于细胞数目，虽然机器的分选速度最高可达70,000细胞/sec，但为得到最佳分选结果，我们通常设定分选速度为10,000-20,000细胞/秒。因此，如欲分选2×107细胞，其所需分选时间约为17-34分钟。分选后约需15-20分钟去回测及分析结果。所以，总共约需1-1.2小时去分选2×107细胞。
Q5. 一个样品可以同时分选出几种细胞?
Ans: FACSAria可以从一个样品中最多同时分选出四种不同的细胞。
Q6. 可以同时使用多少参数进行细胞分选？
Ans: FACSAria最多可以根据15个参数去定义及分选一群细胞 (检测488 nm 激光对应的5种荧光信号及SSC和FSC，监测633 nm 激光对应的2种荧光信号，检测375nm 激光对应的2种荧光信号，另有四个可扩充的空白通道)。
Q7. 分选后细胞的纯度有多少？
Ans: 通常可以达到95%以上的纯度，如果所分选细胞可以和其他细胞群较好的区分。
Q8. 如果阳性的细胞占总数的1%以下，还可以做分选吗？
Ans: 可以，但是低含量细胞的分选会导致低纯度及低回收率。因此，我们建议使用者事先富集你感兴趣的细胞。细胞富集的方式可以是正选：如用磁珠法富集你感兴趣的细胞；也可以是负选，如利用nylon wool去除B细胞，或磁珠法去除不要的细胞。
Q9. 分选时所使用的管子有哪些？
Ans: 上样一般使用5ml带盖流式管(BD Falcon tube #352003)；收集可以使用下面这2种管，14ml圆底离心管(BD Falcon tube #352059) (最多双路分选)，5ml带盖流式管(Falcon tube #352003) (最多四路分选)。
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